Комбинация двух CpG олигонуклеотидов из генома бактерий рода Klebsiella, вызывающая созревание in vitro моноцитарных дендритных клеток

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОМБИНАЦИЯ ДВУХОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ИЗ ГЕНОМА БАКТЕРИЙ РОДА , ВЫЗЫВАЮЩАЯ СОЗРЕВАНИЕМОНОЦИТАРНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Титов Леонид Петрович Гончаров Андрей Евгеньевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Комбинация двухолигонуклеотидов из генома бактерии рода , имеющих нуклеотидную последовательность 5- и 5, при их объемном соотношении 11, вызывающая созреваниевыделенных адгезией на пластике моноцитарных дендритных клеток с усиленной продукцией интерлейкина-12 и уменьшенной продукцией интерлейкина-10. Изобретение относится к области медицины, в частности к методам биотехнологии и клеточной иммунотерапии, и может быть использовано для подготовки дендритных клеток с целью клеточной иммунотерапии. В последнее десятилетие для индукции иммунного ответа у больных с хроническими инфекционными и онкологическими заболеваниями используются полученные из моноцитов антигенспецифические моноцитарные дендритные клетки 1. 14 моноциты культивируются в питательной среде с человеческими рекомбинантными цитокинами гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) и интерлейкином-4 (ИЛ-4), под действием которых происходит дифференцировка моноцитов в незрелые моноцитарные дендритные клетки. Полученные незрелые дендритные клетки праймируются антигеном и культивируются с индукторами созревания 1, 2. В известных методиках получения зрелых дендритных клеток используют различные индукторы созревания, например рекомбинантный человеческий фактор некроза опухолей - альфа(ФНО-), С 40-лиганд (40) или липополисахарид (ЛПС) 2. О созревании клеток судят по изменению морфологии клеток, усилению экспрессии костимуляторных молекул 40, 80, 86, молекулыкласса гистосовместимости -, специфического маркера зрелых дендритных клеток - 83 2, 3. 12704 1 2009.12.30 Недостатками используемых индукторов созревания являются недостаточная продукция провоспалительных цитокинов (в частности интерлейкина-12) под действием ФНО 4, высокая продукция противовоспалительного иммуносупрессивного цитокина - интерлейкина-10 при использовании ЛПС 5. Для индукции созревания плазмацитоидных дендритных клеток также используются олигонуклеотиды, содержащие -мотивы (неметилированные последовательности нуклеотидов пурин-пурин-цитозин-гуанин-пиримидин-пиримидин), имеющие различную нуклеотидную последовательность. Однако известные олигонуклеотиды оказывают эффект только на плазмацитоидные, но не на миелоидные (моноцитарные) дендритные клетки 6. Задачей явилась разработка индуктора созреваниямоноцитарных дендритных клеток, оказывающего эффект на моноцитарные дендритные клетки, с усиленной продукцией интерлейкина-12 и уменьшенной или сравнимой с другими индукторами продукцией интерлейкина-10. Задача решается с помощью комбинации двухолигонуклеотидов из генома бактерии рода,имеющих нуклеотидную последовательность 5 и 5-, при их объемном соотношении 11 вызывающих созреваниевыделенных адгезией на пластике моноцитарных дендритных клеток с усиленной продукцией интерлейкина-12 и уменьшенной продукцией интерлейкина-10. Данные олигонуклеотиды могут быть синтезированы автоматическим твердофазным методом с последующей очисткой -электрофорезом и жидкостной хроматографией. Новизна изобретения заключается в использовании комбинации двух нуклеотидных последовательностей, содержащих -мотивы из генома бактерий родадля индукции созревания моноцитарных дендритных клеток, полученных из моноцитов, выделенных адгезией на пластике. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Исследование фенотипа зрелых моноцитарных дендритных клеток. Эксперименты проводились на незрелых моноцитарных дендритных клетках, полученных из моноцитов, выделенных адгезией на пластике. Из крови здоровых доноров(9) центрифугированием на градиенте плотности фиколл-пака (, США) выделяли фракцию мононуклеаров, затем из полученной суспензии клеток выделяли моноциты методом адгезии на пластике (, Германия). Для получения незрелых дендритных клеток моноциты культивировали 7 суток в питательной среде -1640 с 10 телячьей эмбриональной сыворотки, -глютамином, пируватом натрия и(все производства -, США), содержащей рекомбинантные человеческие цитокины(50 нг/мл ГМ-КСФ и 25 нг/мл ИЛ-4 производства, Канада). Затем в лунку с 5105 незрелых ДК в 1 мл среды, содержащей рекомбинантные человеческие цитокины (25 нг/мл ГМ-КСФ и 12,5 нг/мл ИЛ-4), добавляли индукторы созревания 1-я лунка ФНО- 25 нг/мл ( , Канада), 2-я лунка олигонуклеотиды,содержащие -мотивы 1 и 2 по 10 мкг/мл каждого (Актех, Минск). Клетки культивировали при 37 С в увлажненной атмосфере с 52 в течение 2 суток. После культивирования изучали фенотип полученных дендритных клеток методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител к следующим маркерам 80 ( , США), 83 (-, США), - (, США). Учитывался процент экспрессии маркеров клетками, а также средняя интенсивность флюоресценции. При делении средних уровней флюоресценции экспериментального образца и неокрашенного контроля получали значения относительной интенсивности флюоресценции, которая характеризует количество молекул на клетку. 12704 1 2009.12.30 В результате исследований установлено, что зрелые моноцитарные дендритные клетки, индукция созревания которых проводилась как при помощи ФНО-, так и с использованием предложенной комбинации олигонуклеотидов, экспрессировали сравнимые количества молекул 80, 83 и - (фиг. 1, фиг. 2). На фиг. 1 показан процент экспрессии маркеров 80, 83 и - моноцитарными дендритными клетками, индукция созревания которых проводилась при помощи ФНО- или заявляемой комбинации олигонуклеотидов 1 и 2. На фиг. 2 показана относительная интенсивность флюоресценции маркеров 80,83 и - на моноцитарных дендритных клетках, индукция созревания которых проводилась при помощи ФНО- или заявляемой комбинации олигонуклеотидов 1 и 2. Пример 2 Исследование экспрессии мРНК интерлейкина-10 и интерлейкина-12 зрелыми моноцитарными дендритными клетками. Эксперименты проводились на незрелых моноцитарных дендритных клетках, полученных из моноцитов, выделенных адгезией на пластике. Из крови здоровых доноров(9) центрифугированием на градиенте плотности фиколл-пака (, США) выделяли фракцию мононуклеаров, затем из полученной суспензии клеток выделяли моноциты методом адгезии на пластике (, Германия). Для получения незрелых дендритных клеток моноциты культивировали 7 суток в питательной среде -1640 с 10 телячьей эмбриональной сыворотки, -глютамином, пируватом натрия и(все производства -, США), содержащей рекомбинантные человеческие цитокины(50 нг/мл ГМ-КСФ и 25 нг/мл ИЛ-4 производства, Канада). Затем в лунку с 5105 незрелых ДК в 1 мл среды, содержащей рекомбинантные человеческие цитокины (25 нг/мл ГМ-КСФ и 12,5 нг/мл ИЛ-4), добавляли индукторы созревания 1-я лунка ФНО- 25 нг/мл ( , Канада), 2-я лунка олигонуклеотиды,содержащие -мотивы 1 и 2 по 10 мкг/мл каждого (Актех, Минск). Клетки культивировали при 37 С в увлажненной атмосфере с 5 СО 2 в течении 2 суток. После культивирования проводилось выделение общей РНК, синтез кДНК и изучение экспрессии мРНК цитокинов интерлейкина-10 и интерлейкина-12 р 40 методом полуколичественной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. В результате исследований установлено, что зрелые дендритные клетки, полученные из моноцитов, выделенных адгезией, индукция созревания которых проводилась при помощи предложенной комбинации олигонуклеотидов, при сравнимой с ФНО- экспрессии мРНК иммуносупрессивного цитокина интерлейкина-10 экспрессируют на порядок больше мРНК иммунорегуляторного про-1 цитокина интерлейкина-12 (фиг. 3). На фиг. 3 показана экспрессия мРНК цитокинов интерлейкина-10 и интерлейкина 12 р 40 моноцитарными дендритными клетками, индукция созревания которых проводилась при помощи ФНО- или комбинации заявляемых олигонуклеотиов 1 и 2. Как видно из примеров 1 и 2, предложенная комбинация олигонуклеотидов 1 и 2 индуцирует созревание моноцитарных дендритных клеток, полученных из моноцитов, выделенных адгезией. При сравнимом с ФНО- фенотипе предложенные олигонуклеотиды обладают преимуществом по сравнению с известными индукторами созревания. Так, зрелые дендритные клетки, индукция созревания которых проводилась при помощи предложенной комбинации олигонуклеотидов, экспрессируют на порядок больше мРНК иммунорегуляторного про-1 цитокина интерлейкина-12. Экспрессия мРНК иммуносупрессивного цитокина интерлейкина-10 сравнима при использовании в качестве индукторов созревания как ФНО-, так и предложенной комбинации олигонуклеотидов. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5