Способ подготовки трансплантата островковых клеток поджелудочной железы к посадке в сосудистое русло

(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ТРАНСПЛАНТАТА ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОИ ЖЕЛЕЗЫ К ПОСАДКЕ(71) Заявитель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет (ВУ)(72) Авторы Третьяк Станислав Иванович Горанов Виталий Анатольевич Прохоров Александр Викторович Бильдюкевич Александр Викторович Фенько Людмила Александ ровна (ВУ)(73) Патентообладатель Учреждение обра зования Белорусский государственный медицинский университет (ВУ)Способ подготовки трансплантата островковых клеток поджелудочной железы к посадке в сосудистое русло, включающий их введение в биосовместимый контейнер для трансплантации, отличающийся тем, что клетки в контейнер вводят с помощью стерильного щприца, а в качестве контейнера используют герметичную макрокапсулу объемом 2 мл из полиамидной мембраны с порами радиусом 1,2 мкм, которую перед трансплантацией в сосудистое русло реципиента предварительно помещают не более чем на 20 минутИзобретение относится к медицине, к разделу трансплантология, а именно к подготовке клеток для введения в сосудистое русло, и может быть использовано в лечении дефицитных форм эндокринной патологии (инсулинзависимый диабет, гипотиреоз и др.).Известен способ заключения клеток в кальций-альгинатные микрокапсулы с последующей имплантацией в печеночную вену с целью лечения сахарного диабета 1. При этом в присутствии моновалентных катионов кальция происходит сщивка жидкого полисахарида альгината и образование нерастворимого геля, являющегося основой для иммобилизации клеток. В ходе перемещивания с суспензией клеток с последующим образованием микрокапель с помощью специального микрокапельного генератора клетки и их конгломераты оказываются заключенными в сферическую гелевую мембрану. В последующем инкапсулированные клетки трансплантируют в различные сайты организма. Однако при данном способе клинический эффект кратковременен в связи с отторжением и снижением функциональных способностей трансплантированных клеток 2.Указанный способ является прототипом по отнощению к заявляемому.Однако указанный прототип обладает следующими недостатками.Подвергается отторжению в течение короткого периода (3-4 месяца) за счет действия растворимых иммунных комплексов и молекул комплемента.Вызывает иммунологическую сенсибилизацию организма реципиента.Требует проведения дополнительной иммуносупрессивной терапии.Задача данного изобретения - повышение жизнеспособности клеточного трансплантата, профилактика отторжения культуры островковых клеток при трансплантации в сосудистое русло пациента с сахарным диабетом.Поставленная задача достигается иммобилизацией клеточного трансплантата в специальную капсулу с неадгезивной поверхностью и порами с диаметром, не превышающим 1,2 мкм.Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является создание барьера между клетками организма и трансплантированными клетками. При этом достигается иммуноизоляция путем создания барьера между клетками иммунной системы и трансплантируемь 1 ми клетками, с сохранением достаточного количества активных инсулинпродуцирующих клеток.Способ осуществляется следующим образом.Полиамид растворяют в муравьиной кислоте или смеси ДМАА-ЫС 1, наносят тонким слоем на стеклянную трубку диаметром 0,4 см и коагулируют в водную осадительную ванну. Готовую капиллярную мембрану снимают со стеклянной трубочки и отмывают дистиллированной водой от остатков растворителя. Для фиксации пористой структуры мембрану импрегнируют 10 раствором глицерина и высушивают. Полученная мембрана имеет производительность фильтрации 100 мл/миксм 2 при давлении 0,7 атм., размер пор до г 1,2 мкм.Общий объем клеточной суспензии, предназначенной для трансплантации доводят до 2 мл с помощью центрифугирования и вводят в контейнер, предназначенный для трансплантации с помощью стерильного шприца.Для герметизации капсулы используют стандартный анатомический пинцет, бранщи которого разогревают над огнем спиртовой горелки и затем охлаждают (контроль - электрический термопарный термометр) до температуры 250 С. Затем края отверстия макрокапсулы сближают с некоторым усилием до полного сплавления. Капсула должна находиться в свежей культуральной среде до момента помещения в организм реципиента не более 20 минут.Полученную макрокапсулу трансплантируют в сосудистое русло реципиента сахарным диабетом.При этом у реципиентов происходит значительное снижение потребности в экзогенном инсулине.Таким образом, по сравнению с прототипом указанный способ обладает следующими преимуществами1. Обеспечивает высокую жизнеспособность и функциональную активность адаптированного клеточного трансплантата в условиях 111 уйуо.2. Предупреждает отторжение трансплантата со стороны иммунокомпетентных клеток.3. Создает оптимальные условия трофики и взаимодействия Б-клеток и клеток других типов с потенциалом образования органотипической структуры.Пациентка Не 1. После трансплантации был произведен мониторинг уровней гликемии и изменения инсулинотерапии, что проявилось в постепенном снижении потребности в экзогенном инсулине на 62 с 54 Ед до 21 Ед в течение 2 месяцев. Кроме того, в указанный период за счет компенсации диабета функционирующими Б-клетками произощло снижение среднесуточного уровня гликемии с 9,8 мМ до 4,5 мМ. Функциональная актив НОСТЬ трансплантированнь 1 х В-КЛСТОК уЖС ЧСРСЗ 2 НСДСЛИ ПОСЛС ПСРВСЗДКИ была верифи 2цирована с помощью определения уровня С-пептида, который поднялся от нулевой отметки до 28 Ед - базальный уровень И 36 Ед - стимулированнь 1 й (постпрандиальнь 1 й) уровень. Кроме того, отмечается субъективное улучшение состояния пациентки. Ее вес увеличился на 2 кг.В настоящий момент самочувствие пациентки - хорошее. За истекший год фактически не Произошло увеличения потребности в экзогенном инсулине (28 Ед/сутки). Кроме того,отмечен рост компенсаторных процессов, характеризующих метаболические изменения,что нашло подтверждение в снижении гликирования протеинов. Уровень фруктозамина снизился с 378 до 332 мМоль, а уровень гликированного гемоглобина находится в пределах 7,9-8,1 , в то время как до операции он не снижался ниже 8,3 по данным электрофоретических наборов.Кроме того, отмечен рост показателей, непосредственно характеризующих функциональную активность пересаженнь 1 х клеток. При этом уровень тощакового иммунореактивного инсулина поднялся с нулевой отметки до уровня 31,1 Ед/мл через 3 месяца после операции и до отметки 45,7 Ед/мл к настоящему моменту. Показатели секреции Спептида, которые до операции как натощак, так и после функциональной нагрузки не превь 1 шали 0,2 Ед, после операции в течение месяца поднялись до значений 28 Ед - натощак и 36 Ед - в постпрандиальнь 1 й период. Через 6 месяцев данный показатель тощакового С-пептида имел значение 41 Ед.Особое внимание привлекли к себе показатели иммунологического статуса данной пациентки. При рутинном анализе показателей иммунограммь 1 2 уровня было выявлено снижение иммунорегуляторного индекса с 4,6 до 3,2. Кроме того, через 1 месяц после операции количество активированных лимфоцитов снизилось с 797 на микролитр до 408. Произошло увеличение количества СВ 95 - лимфоцитов, определяемых по методике с использованием проточной цитофлюориметрии (аутоантитела СВ 95/Р 1 Т 5, Москва) до 16,4 (до операции 8,5 1 4,5 ). Следует отметить, что, согласно некоторым литературным данным, для здоровых лиц характерен еще более высокий уровень экспрессии СВ 95,определяемый с помощью иммуноферментного способа и составляющий 39,58 0,34 . Произошло также снижение уровней активационных лимфоцитарных маркеров (СВ 25,СВ 71, СВ 69, СВ 45, НЬА-ВК) и количества иммуноглобулина 6, что в целом свидетельствует о стабилизации показателей иммунного статуса.Таким образом, по сравнению с прототипом указанный способ обладает следующими преимуществами1. Высокая жизнеспособность и функциональная активность адаптированного клеточного трансплантата в условиях 111 уйуо.2. Эффективная защита трансплантируемых клеток от клеточно-опосредованного иммунитета.Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.