Индуктор созревания моноцитарных дендритных клеток in vitro

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ИНДУКТОР СОЗРЕВАНИЯ МОНОЦИТАРНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Титов Леонид Петрович Гончаров Андрей Евгеньевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Применение комбинации, состоящей из фактора некроза опухоли-альфа и дибутирилцАМФ, в качестве индуктора созревания моноцитарных дендритных клеток. Изобретение относится к области медицины, в частности к методам биотехнологии и клеточной иммунотерапии, и может быть использовано с целью подготовки дендритных клеток для клеточной иммунотерапии. В последнее десятилетие для индукции иммунного ответа у больных с хроническими инфекционными и онкологическими заболеваниями используются полученные из моноцитов антигенспецифические моноцитарные дендритные клетки 1. 14 моноциты культивируются в питательной среде с человеческими рекомбинантными цитокинами гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) и интерлейкином-4 (ИЛ-4), под действием которых происходит дифференцировка моноцитов в незрелые моноцитарные дендритные клетки. Полученные незрелые дендритные клетки праймируются антигеном и культивируются с индукторами созревания 1, 2. В известных методиках получения зрелых дендритных клеток в качестве индуктора созревания чаще всего используется рекомбинантный человеческий фактор некроза опухолей-альфа (ФНО) 2. О созревании клеток судят по изменению морфологии клеток, усилению экспрессии костимуляторных молекул 40, 80, 86, молекулыкласса гистосовместимости -, специфического маркера зрелых дендритных клеток - 83 2, 3. Недостатком известного индуктора созревания ФНО- является неполная индукция созревания клеток, при этом относительное количество зрелых 83 клеток в культуре составляет менее 504. Задачей явилась разработка индуктора созреваниямоноцитарных дендритных клеток, под действием которого происходит созревание порядка 90 дендритных клеток в культуре. 12361 1 2009.08.30 Задача решается тем, что в качестве индуктора созревания моноцитарных дендритных клетокприменяют комбинацию, состоящую из фактора некроза опухоли-альфа и дибутирил-цАМФ. Дибутирил-цАМФ - 6,2-О-дибутириладенозин 3,5-цАМФ (-), представляет собой аналог эндогенного цАМФ 5. Из литературных данных неизвестно использование- или комбинаций его с другими веществами в качестве индуктора созревания дендритных клеток. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример. Исследование фенотипа зрелых моноцитарных дендритных клеток. Эксперименты проводились на незрелых моноцитарных дендритных клетках, полученных из моноцитов, выделенных адгезией на пластике. Из крови больных острыми и хроническими вирусными гепатитами В и С (7) центрифугированием на градиенте плотности фиколл-пака (, Ш) выделяли фракцию мононуклеаров, затем из полученной суспензии клеток выделяли моноциты методом адгезии на пластике (,Германия). Для получения незрелых дендритных клеток моноциты культивировали 7 суток в питательной среде -1640 с 10 телячьей эмбриональной сыворотки, -глютамином, пируватом натрия и(все производства -, США), содержащей рекомбинантные человеческие цитокины (50 нг/мл ГМ-КСФ и 25 нг/мл ИЛ-4, производства, Канада). Затем в лунку с 5105 незрелых ДК в 1 мл среды, содержащей рекомбинантные человеческие цитокины (25 нг/мл ГМ-КСФ и 12,5 нг/мл ИЛ-4), добавляли индукторы созревания 1-я лунка ФНО- 50 нг/мл ( , Канада), 2-я лунка комбинация ФНО- 50 нг/мл- (-, США) в концентрации 500 мкг/мл. Клетки культивировали при 37 С в увлажненной атмосфере с 52 в течение 1 суток. После культивирования изучали фенотип полученных дендритных клеток методом проточной цитофлюориметрии, с использованием моноклональных антител к следующим маркерам 80 ( , США), 83 (-, США), 86 и (, США). Учитывался процент экспрессии маркеров клетками, а также средняя интенсивность флюоресценции. При делении средних уровней флюоресценции экспериментального образца и неокрашенного контроля получали значения относительной интенсивности флюоресценции, которая характеризует количество молекул на клетку. В результате исследований установлено, что в сравнении с ФНО- комбинацияи ФНО- статистически достоверно увеличивает относительное число клеток, экспрессирующих костимуляторные молекулы 80, 86 и специфический маркер зрелых дендритных клеток 83 на моноцитарных дендритных клетках (фиг. 1). При этом процент зрелых 83 дендритных клеток составлял во всех опытах 90,091,30 , по сравнению с ФНО- - 40,028,22 (0,001). Значения относительной интенсивности флюоресценции,характеризующей количество молекул на клетку, были также достоверно (0,05) выше при использовании комбинации - и ФНО- (фиг. 2). На фиг. 1 показан процент экспрессии маркеров 83, 80, -, 86 моноцитарными дендритными клетками, индукция созревания которых проводилась при помощи ФНО- или заявляемой комбинации ФНО- и -сАМР. Примечаниядостоверные различия по сравнению с ФНО-, 0,05 достоверные различия по сравнению с ФНО-, 0,001. На фиг. 2 показана относительная интенсивность флюоресценции маркеров 83,80, -, 86 на моноцитарных дендритных клетках, индукция созревания которых проводилась при помощи ФНО- или заявляемой комбинации ФНО- и -. Примечаниядостоверные различия по сравнению с ФНО-, 0,05 достоверные различия по сравнению с ФНО-, 0,001. 2 Фиг. 2 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3