Биоаффинный сорбент для избирательного выделения активатора плазминогена тканевого типа

(51)( 01130148 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИ СОБСТВЕННОСТИДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА ТКАНЕВОГ О ТИПА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(72) Авторы Голубович Владимир Петрович Никандров Виталий Николаевич Галюк Елена Николаевна Мартинович Вера Павловна (ВУ)(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук БеларусиБиоаффинный сорбент для избирательного выделения активатора плазминогена тка невого типа, который в качестве биоаффинного лиганда содержит гепарин, а в качестве матрицы-носителя - полиакриламидный гель, и в котором участок полимерной цепи с лигандом представляет собой звено формулыгепарин, где п 5-50 - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации гепариновых лигандов.Изобретение относится К области биоорганической химии, препаративной биохимии и Медицины и представляет собой новый гепаринсодержащий сорбент, биоспецифичнь 1 й относительно активатора плазминогена тканевого типа (т-АП). Данный сорбент может применяться для получения вь 1 сокоочищеннь 1 х препаратов тканевого активатора плазминогена, пригодных для использования в лабораторно-диагностических и лечебных целях.Высокая научно-практическая значимость изобретения обусловлена ключевой ролью т-АП в развитии и протекании ряда важнейших физиологических процессов. Основными функциями т-АП являются 1, 2 регуляция процессов фибринолиза участие в процессе овуляции, сперматогенеза, эмбрионального развития участие в перестройке межклеточного матрикса обеспечение процессинга ряда гормонов и факторов роста, превращение пролактогена, проинсулина, проопиомеланокортина в активные гормоны участие в процессе гибели клеток.Необходимость коррекции этих процессов при разнообразных заболеваниях, в т.ч. сосудистой, онкологической патологии и т.д. диктует наработку очищенных препаратов тАП в значительном количестве. Однако препараты очищенного т-АП до сих пор остаются дефицитными и дорогими. Известные способы получения очищенных образцов основаны на использовании приема аффинной хроматографии. В качестве аффинных сорбентов используются лизин-сефароза 3, аргинин-сефароза 4, р-аминобензоамидин-сефароза 4. Прототипом является гепарин-сефароза - сорбент, матрицей которого служит сефароза, а биоаффинным лигандом - гепарин 5. Использование этих сорбентов позволяет получить образцы активатора плазминогена высокой чистоты. Однако перечисленные сорбенты очень дороги и подвержены Микробиологическому разрушению.Задачей изобретения было получение нового сорбента для избирательного выделения т-АП, биоселективным лигандом которого является гепарин, полимером-матрицей служит полиакриламидный гель (ПААГ). Задача рещается заявляемым сорбентом, который в качестве биоаффинного лиганда содержит гепарин, а в качестве матрицы-носителя - полиакриламидный гель, и в котором участок полимерной цепи с лигандом представляет собой звено формулыгепарин где п 5-50 - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации гепариновь 1 х лигандов.Использование гепарина в качестве биоселективного лиганда было обусловлено его способностью образовывать в растворе комплексное соединение с т-АП. Этот комплекс имеет постоянный состав и мольное соотношение компонентов 1 1. Существование данного комплекса подтверждалось смещением изоэлектрической точки т-АП в присутствии гепарина, утрате т-АП способности осаждаться в условиях изоэлектрической точки (рН 6,2-6,4),и осаждением комплекса при рН 3,8-4,3 б.Выбор полиакриламидной матрицы был обусловлен ее стабильностью, биологической инертностью, возможностью введения лиганда на стадии полимеризации 7. Для превращения вводимого в качестве лиганда гепарина в мономер проводили его ацилирование по аминогруппам остатка глюкозамина с помощью акрилоилхлорида. Полученный Ы-акрилоилгепарин использовали как мономер при сополимеризации акриламида и 1 Т,1 Г-метиленбисакриламида в присутствии персульфата аммония и М,М,М,1 Г-тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации.100 мг гепарина растворяли в 100 мл 2 -ного раствора гидрокарбоната натрия при перемешивании и слабом нагревании до 30 С. К полученному раствору приливали 0,2 мл акрилоилхлорида. Смесь энергично перемешивали 1 ч. при 30 С. При этом происходит постепенное растворение акрилоилхлорида. Раствор декантировали от нерастворившихся продуктов и добавляли К нему 4,6 г акриламида, 0,48 г М,1 Г-метиленбисакриламида. Смесь перемешивали до полного растворения, затем добавляли 0,2 г М,1 Т,1 Г,1 Г-тетраметилендиамина и 0,4 г персульфата аммония и оставляли для полимеризации, которая происходит спустя 1,5-2 мин. Равномернь 1 й плотный слой гепарин-ПААГ (около 100 мл) выдерживали 1 ч. при комнатной температуре, затем измельчали с помощью шприца с диаметром вь 1 ходного отверстия 3 мм. Опалесцирующие гранулы гепарин-ПААГ промывали многократно дистиллированной водой (общий объем около 3 л), а затем 0,9 -нь 1 м раствором хлорида натрия (общий объем около 1,5 л). Отмь 1 ть 1 й гель хранили в холодильнике в0,9 -ном растворе хлорида натрия. Содержание гепарина в набухшем геле составляло 20-25 мкг/мл.Выделение т-АП с использованием гепаринсодержащего сорбента (первый способ).400 г замороженного (-20 С) свиного сердца размораживали, измельчали и гомогенизировали в Н 2 О. Осадок отделяли центрифугированием ( 10000 20 мин) и затем смешивали с ацетоном, предварительно охлажденным до -20 С. Суспензию перемешивали при 0 С и фильтровали на воронке Бюхнера. Осадок повторно обезвоживали ацетоном при тех же условиях, фильтровали и сушили 2 ч на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Полученный сухой остаток гомогенизировали в 0,1 М Ма-фосфатном буфере рН 7,3, содержащем 20 мМ е-аминокапроновую кислоту и 0,1 М 1 ТаС 1. Осадок отделяли центрифугированием ( 10000 30 мин) и смешивали с 0,45 М К-ацетатным буфером рН 4,2 и экстрагировали в течение ночи. Затем проводили центрифугирование (10000 30 мин). Осадок повторно экстрагировали в 0,3 М К-ацетатном буфере рН 4,2 и затем отделяли центрифугированием (10000 30 мин). Полученные супернатанты объединяли и медленно добавляли к ним сухой сульфат аммония до 55 насыщения. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием ( 10000 30 мин) и растворяли в 20 мМ Мафосфатном буфере рН 6,5. Полученный раствор подвергали диализу, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием. Приготовленный таким образом образец наносили на колонку с гепарин-содержащим сорбентом. Фракции с т-АП элюировали КСЫЗ. Активные фракции объединяли и концентрировали ультрафильтрацией на мембране РМ-10. Активность учитывали фибринолитическим методом 8. Концентрацию белка определяли по методу Лоури 9.Образец, наносимый на колонку с гепарин- 1100 562,5 619000 содержащим сорбентом Пул фракций с активностью т-АПВ КЗЧССТВС стандарта ИСПОЛЬЗОВЗЛИ стрептокиназу, активность выражена В МВЖДУНЗрОДНЫХ ВДИНИЦЗХ стрептокиназь 1.Выделение т-АП с Использованием гепаринсодержащего сорбента (второй способ).Г СВИНОГО сердца высушивали, гомогенезировали, экстрагировали И вь 1 саливали ПрИ таких же УСЛОВИЯХ ЧТО И В ПрИМСр 6 Однако ПОСЛС растворения осадка, ПОЛУЧСННОГО при высаливании сульфатом аммония, в раствор добавляли ингибитор протеаз - контрикал. Так как контрикал ПОДЗВЛЯВТ активность И Т-АП, расчет СТСПСНИ ОЧИСТКИ В данном примере производился относительно образца, не содержащего контрикал.Общее Специфическая кол-во Белок, Объем, Всего, Степень Стадия очистки активность,белка, мг/мл мл МЕ/МГ МЕ очистки мгРезультаты получения и очистки т-АП приведены в таблицах примеров 2 и 3. Применение гепаринового сорбента позволило получить препарат т-АП, содержащий около 98 чистого фермента. Простота получения, стабильность при хранении, высокое сродство к т-АП делают сорбент гепарин-ПААГ весьма удобным в случае практического применения для выделения и очистки тканевого активатора плазминогена (т-АП).3. КЭЙСНЙ К, Нейпие Т. 15 о 1 айоп оГ р 1 а 5 ш 1 по 3 еп асйуагог Ггош Пишап р 1 а 5 ша Ьу с 11 гошагогарпу оп 1 у 51 пе-5 ер 11 аго 5 е// Агс 11. В 1 ос 11 еш. В 1 ор 11 у 5.- 1978.- Уо 1 189, Не 1. -Р. 185-194.4. 77 а 11 еп Р., Ро 111 6., Ветзбогг М., КапЬу М., Ыу Т., ошуа 11 Н. Ригййсайоп апб сЬагасгегшагйоп оГ а ше 1 апоша се 11 ршзшйпоеп асйуагог // Еиг. 1. В 1 ос 11 еш.- 1983.-/о 1. 132, Не 3 Р. 681-686.5. Зоеба 5., Ка 1111 М., 5111 шепо Н., Ыаашагзи А. Карта апб 111311-у 1 е 1 б ригййсайоп оГ рогсйпе Ьеап йззие-уре ршзшйпоеп асйуагог Ьу Ьерагйп-зерпагозе спотошагогарпу // ЫГе 501. 1986. - 701. 39. - По 15. - Р. 1317-1324 (прототип).6. Шимонаева Е.Е., Шимонаев Г.С. Алешина Т.С. Комплекс гепарин-тканевой активатор плазминогена и некоторые его свойства // Биохимия. - 1983. - Т. 48. - Не 10. - С. 1687-1690.7. Чучалин А.Г. Новые методы лечения экстракорпоральная специфическая имму носорбция // Итоги науки и техники Сер. Иммунология. - М ВИНИТИ, 1987.-Т. 116. С. 146-178.8. Азгшр Т., МйПегш 5. Т 11 е йЬгйп р 1 аге шешоб Тог езйшагйп Г 1 Ьг 1 по 1 уйс асйупу // Агс 11. В 1 ос 11 еш. В 1 ор 11 у 5. - 1952. - Уо 1.40. - По 2. - Р. 346-351. 9. Ьошгу О.Н., КозеЬогоип 1 Т.., Рагг А.Ь. е а 1. Ргогейп шеазигешеш шин 101111 р 11 епо 1Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.