Способ получения антигена 24 кДа для иммуноферментной диагностики туберкулеза
Номер патента: 9080
Опубликовано: 30.04.2007
Авторы: Лысенко Александр Павлович, Федорович Сергей Владимирович, Максименко Алла Анатольевна, Яковлева Людмила Федоровна, Соколов Сергей Михайлович
Текст
(51)01 33/531 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА 24 кДа ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Яковлева Людмила Федоровна Соколов Сергей Михайлович Федорович Сергей Владимирович Лысенко Александр Павлович Максименко Алла Анатольевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(57) Способ получения антигена 24 кДа для иммуноферментной диагностики туберкулеза,включающий осаждение и фракционирование антигена из культурального фильтратаили, отличающийся тем, что культуральный фильтрат, содержащий 3 фенола, выдерживают при температуре 2-8 С до выпадения осадка легкокристаллизующихся антигенов, осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере рН 8,6, обрабатывают в течение 25-30 мин ультразвуком с частотой 15-35 кГц мощностью 100 Вт/см 2, очищают гель-фильтрацией и отбирают фракции, содержащие антиген 24 кДа. Изобретение относится к биотехнологии, в частности медицинской и ветеринарной иммунологии и лабораторной диагностике. Известен способ получения антигена, характерного для возбудителей туберкулеза бычьего и человеческого вида и не встречающегося у атипичных микобактерий, заключающийся в выделении из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза антигена путем осаждения белков сульфатом аммония в 75 насыщении, диализа для удаления солей, хроматофокусировании на МооР колонке, аффинной хроматографии на сефарозе с Конканавалином А и гель-фильтрации на Биогеле Р 100 1. Указанный способ является прототипом к заявляемому. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются использование культурального фильтрата в качестве исходного материала, осаждение фракции, содержащей целевой продукт. Однако способ-прототип обладает недостаточно высокой специфической активностью, в силу которой возникают проблемы с частичной денатурацией и снижением активности микобактериальных антигенов. 9080 1 2007.04.30 Задачей заявляемого способа является повышение видоспецифичности указанного антигена. Поставленная задача достигается путем того, что предложен способ получения антигена 24 кДа для иммуноферментной диагностики туберкулеза, включающий осаждение и фракционирование антигена из культурального фильтратаили, когда культуральный фильтрат, содержащий 3 фенола, выдерживают при температуре 2-80 С до выпадения осадка легкокристаллизующихся антигенов,осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере рН 8,6, обрабатывают в течение 2530 мин ультразвуком с частотой 15-35 кГц мощностью 100 Вт/см 2, очищают гельфильтрацией и отбирают фракции, содержащие антиген 24 кДа. Пример. Штаммы 37,,8 выращивают на среде Сотона в течение 8 недель при 370 С, инактивируют внесением в посевы фенола до конечной концентрации 3 . Бактериальную массу удаляют центрифугированием при 3000 , 20 мин, культуральную жидкость пропускают через стерилизующий фильтр. По 500 мл культуральных фильтратов помещают в холодильник с температурой 2 80 С до выпадения легкого осадка, который обрабатывают ультразвуком 15-35 кгц в течение 15-20 мин, центрифугируют 5-7 мин при 500. Полученный осадок удаляют, а надосадочную культуральную жидкость повторно центрифугируют и обрабатывают ультразвуком. Полученные антигенные фракции дополнительно очищают гель-фильтрацией на колонке 2137 (2,665 см) с ультрогелем АсА 54, откалиброванной по элюции белков с известной молекулярной массой. Скорость элюции поддерживают на уровне 3,5-3,8 см/ч. Оптическую плотность элюатов определяют на проточном спетрофотометре-2 при 267 нм. Специфичность фракций исследуют в ИФА (табл. 1, степень очистки определяют в перекрестном иммуноэлектрофорезе с промежуточным гелем). Таблица 1 Фракции культурального фильтрата М.37 Исходные антигенные фракции Очищенные антигенные фракции М.37 М.37 Разведения анантисыворотка к ан- антисыворотка антисыворотка к антисыворотка тисывороток тигенам атипичных .антигенам атипич- к М. микобактерий 37 ных микобактерий 37 х х х х 1200 2,3 2,5 1,7 2,4 1400 2,3 2,6 1,8 2,3 1800 2,0 2,2 1,5 2,8 11600 2,0 2,3 1,2 2,0 М 2,150,07 2,40,07 1,550,11 1,930,14 ИСА 1,12 1,3 Примечание х- отношение оптической плотности (ОП) с антисыворотками к антигенам атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки крови. ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения ОП с антисывороткой к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий курсивом показаны отрицательные реакции. Как видно из табл. 1, очищенные фракции культуральных фильтратов штаммов М.37 практически не реагируют в иммуноферментном анализе, т.е. не вступают в реакции с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий (пре 2 9080 1 2007.04.30 вышение ОП в сравнении с нормальной сывороткой менее 2,0) и достаточно интенсивно реагируют с гомологичными антисыворотками. Таблица 2 Показатели перекрестной и специфической активности в ИФА элюатов фракции. , полученных при гель-фильтрации на ультрогеле АсА 54 ИсходНомера элюатов с ультрогеля АсА 54 фракции . ,ный выпадавшей в осадок с 3 фенола, и показатели перекрестной Покакультуспецифической активности затель ральный 10 13 17 18 20 21 25 28 фильтрат 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ИПА 5,8 1,8 2,8 2,0 1,6 1,7 1,2 1,3 1,5- ИПА - индекс перекрестной активности, ИСА - индекс специфической активности ИПА(средний показатель ОП с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий)(ОП нормальной сыворотки) ИСА(средний показатель с антисывороткой к антигенам возбудителя туберкулеза)(средний показатель ОП с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий). Как видно из таблицы 2, элюаты 17-21 не реагируют в ИФА (в разведениях 1100 и выше) с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий (ИПА ниже 2,0), но дают выраженные реакции с гомологичной антисывороткой (ИСА больше 2,0). Анализ антигенной нагрузки показывает, что в диапазоне фракций 17-21 с колонки элюируется только иммунохимически чистый антиген со средней массой 24 кДА. Аналогичным образом получают антигены штаммов М.37. Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ обладает следующими преимуществами позволяет получать активный и высокоспецифичный антиген, пригодный для иммуноферментной диагностики туберкулеза, существенно упростить его получение. Источники информации 1.// . . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3
МПК / Метки
МПК: G01N 33/531
Метки: кда, антигена, получения, способ, диагностики, иммуноферментной, туберкулеза
Код ссылки
<a href="https://by.patents.su/3-9080-sposob-polucheniya-antigena-24-kda-dlya-immunofermentnojj-diagnostiki-tuberkuleza.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ получения антигена 24 кДа для иммуноферментной диагностики туберкулеза</a>
Предыдущий патент: Способ определения показателя фрактальной размерности поверхности бумаги
Следующий патент: Мастика битумно-полимерная ингибированная
Случайный патент: Способ изготовления межкомпонентной изоляции КМДП интегральных схем