Способ получения антигенов Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis

(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Яковлева Людмила Федоровна Федорович Сергей Владимирович Казакова Татьяна Михайловна Лысенко Александр Павлович Богданович Сергей Владимирович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(57) Способ получения антигенов из микобактерий, выбранных из группыи, включающий культивирование микобактерий, осаждение антигенов из стерилизованного культурального фильтрата и их фракционирование гель-фильтрацией, отличающийся тем, что микобактерии после культивирования дополнительно инактивируют путем внесения фенола до концентрации 3 , а осаждение антигенов проводят, выдерживая культуральный фильтрат, содержащий 3 фенола, при температуре 2 - 8 С, затем осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере,8,6,добавляя по каплям 25 раствор аммиака, и антигены выделяют одноэтапной гельфильтрацией. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской и ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторной диагностике, и касается получения антигенов,, которые могут быть использованы для иммунодиагностики туберкулеза. Известно, что для получения микобактериальных антигенов применяют аффинную хроматографию с использованием поликлональных и моноклональных антител, лектинов,а также физико-химические методы, включающие осаждение сульфатом аммония, жидкостную и ионообменную хроматографию, изоэлектрофокусирование или электрофорез. При этом получают микобактериальные антигены разной специфичности и степени очистки (антиген 5, БЦЖ 60, МРТ 59, МРТ 64, МРВ 70, 6, Т 38, , 10, 65, ТВ 70). Известен способ получения антигена, характерного для возбудителей туберкулеза бычьего и человеческого вида и не встречающегося у атипичных микобактерий, заключающийся в выделении из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза антигена путем осаждения белков сульфатом аммония в 75 насыщении, диализа для удаления солей, хроматофокусировании наколонке, аффинной хроматографии на сефарозе с 7794 1 2006.02.28 Конканавалином А и гель-фильтрации на Биогеле Р 100 2. Указанный способ является прототипом к заявляемому. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются использование культурального фильтрата в качестве исходного материала, осаждение фракции, содержащей целевой продукт, и его очистку с помощью гель-фильтрации. Однако способ-прототип обладает недостатками в силу своей сложности, для его осуществления необходимо выполнение 5-6 стадий очистки и целого ряда промежуточных этапов (что требует затраты дополнительного времени), при осуществлении которых возникают проблемы с частичной денатурацией и снижением активности антигенов. Задачей заявляемого способа является повышение активности и специфичности получаемых антигенов,. Поставленная задача достигается путем того, что предложен способ получения антигенов из микобактерий, выбранных из группыи, включающий культивирование бактерий, осаждение антигенов из стерилизованного культурального фильтрата и их фракционирование гель-фильтрацией, когда бактерии после культивирования дополнительно инактивируются путем внесения фенола до концентрации 3 , а осаждение антигенов проводят, выдерживая культуральный фильтрат,содержащий 3 раствор фенола, при температуре 2 - 8 С, затем осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере,8,6, добавляя по каплям 25 раствор аммиака, и антигены выделяют одноэтапной гель-фильтрацией. Пример конкретного выполнения. Штаммы 37,,8 выращивают на среде Сотона в течение 8 недель при 37 С, инактивируют внесением в посевы фенола до конечной концентрации 3 . Бактериальную массу удаляют центрифугированием при 300020 мин, культуральную жидкость пропускают через стерилизующий фильтр. По 500 мл культуральных фильтратов помещают в холодильник с температурой 28 С до спонтанного выпадения легкого осадка, из других 500 мл сульфатом аммония 75 насыщения осаждают антигенсодержащую фракцию. В обоих случаях осадок собирают центрифугированием при 300020 мин. Спонтанно выпавший осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере 8,6, добавляя по каплям 25 раствор аммиака, и очищают одноэтапной гель-фильтрацией. Осадок, полученный преципитацией сульфатом аммония, растворяют в 0,9 растворе хлорида натрия и диализируют общепринятым способом. В табл. 1 приведены данные по влиянию способа осаждения на активность и специфичность в иммуноферментном анализе (ИФА) антигенов. Как видно из табл. 1, исходный культуральный фильтрат интенсивно реагирует с антисыворотками во всех разведениях. После осаждения сульфатом аммония активность антигенов возбудителя туберкулеза заметно снижается и положительная реакция (превышение ОП 2,0 и более) отмечается только до разведения 16400, специфичность существенно не меняется и индекс специфической активности (ИСА) возрастает с 1,2 до 1,5 (на 25 ). Осадок, выпадающий при выдерживании культурального фильтрата с 3 фенола,обладает достоверно более высокой активностью, давая с антисывороткой М. , разведенной 112800, превышение ОП в 11,2 раза. При этом перекрестные реакции с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий наблюдаются только до разведения антисыворотки 13200, а ИСА составляет 2,8 (рост на 133 ). Осаждение сульфатом аммония существенно не увеличивает специфичность антигенов возбудителя туберкулеза и несколько снижает их активность, в то время как антигены,спонтанно выпадающие в осадок при выдерживании культурального фильтрата с 3-5 фенола, обладают достоверно более высокой активностью и специфичностью. Высокие показатели полученной фракции были характерны и для других штаммов 7794 1 2006.02.28 Таблица 1 Влияние способа осаждения на специфичность и активность антигенов возбудителя туберкулеза Исходный Осадок,Осадок, выпавший при культуральный преципитированный выдерживании культуРазвефильтрат сульфатом аммония рального фильтрата дения М.75 насыщения с 3 фенола антиантисыворотка антисы- антисыворотка антисы- антисыворотка антисысывок антигенам воротка к к антигенам воротка к к антигенам воротка к роток атипичных М.атипичных М.атипичных М.микобактериймикобактерий- отношение оптической плотности /ОП/ с антисыворотками к антигенам атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки крови ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения ОП с антисывороткой М.к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий курсивом показаны отрицательные реакции. Таблица 2 Активность и специфичность в ИФА фракции культурального фильтрата М.8, спонтанно выпадающей в осадок Осадок, выпавший при выдерживании Исходный культуральный фильтрат культурального фильтрата М.8 с Разведения М.8 5 фенола антисывоантисыворотка к антисыворотка антисыворотка к анроток антисыворотка к антигенам атипичк М.тигенам атипичных М.ных микобактерий- отношение оптической плотности /ОП/ с антисыворотками к антигенам атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки крови ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения ОП с антисывороткой М.к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий курсивом показаны отрицательные реакции. 7794 1 2006.02.28 Таблица 3 Активность и специфичность в ИФА фракции культурального фильтрата М.37, спонтанно выпадающей в осадок Исходный культуральный Осадок, выпавший при выдерживании культуфильтрат- рального фильтратаРазведения 37 37 с 3 фенола антисыво- антисыворотка антисывоантисыворотка к роток к антигенам ротка к М. антисыворотка антигенам атипичатипичных ми-к М.37 ных микобактерий кобактерий 37 1200 2,3 х 2,5 х 1,7 2,4 х 1400 2,3 2,6 1,8 2,3 1800 2,0 2,2 1,5 2,8 11600 2,0 2,3 1,2 2,0- отношение оптической плотности /ОП/ с антисыворотками к антигенам атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки крови ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения ОП с антисывороткой М.к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий курсивом показаны отрицательные реакции. Как видно из табл. 3, фракции культуральных фильтратов штаммов М.37 практически не дают в ИФА реакций с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий (превышение ОП в сравнении с нормальной сывороткой менее 2,0) и достаточно интенсивно реагируют с гомологичными антисыворотками. Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый Способ получения антигенов обладает следующими преимуществами позволяет получать активные и высокоспецифичные антигены,, которые могут быть использованы для иммунодиагностики микобактериальных заболеваний, существенно упростив при этом способ получения. Источники информации 1.// . . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.