Способ культивирования перевиваемой клеточной линии нейробластомы IMR-32

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ НЕЙРОБЛАСТОМЫ -32(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Романовская Алеся Александровна Никандров Виталий Николаевич Гронская Раиса Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ культивирования перевиваемой клеточной линии нейробластомы -32 в синтетической питательной среде, содержащей биологически активное соединение, в атмосфере с 5 -ным содержанием СО 2 при 37 С и 90 -ной влажности, отличающийся тем, что в качестве биологически активного соединения среда содержит пируваткиназу в концентрации 10-11-10-7 М. Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к разделу культивирования клеточных культур млекопитающих. Известен способ культивирования нервной ткани и нервных клеток млекопитающих, включающий использование синтетической питательной среды с добавлением 0,05 фетальной телячьей сыворотки и 10-8-10-7 моля плазминогена. Культивирование со сменой среды 1 раз в 3 суток продолжают до получения необходимого количества клеток 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является культивирование клеток млекопитающих в синтетической питательной среде с добавлением к ней биологически активной субстанции. Однако способ-прототип не позволяет культивировать клетки в химически определенных условиях из-за некоторого содержания в культуральной среде неидентифицированных компонентов сыворотки, присутствие которых не позволяет достоверно исследовать влияние факторов различной природы на культивируемые клетки,т.к. остается невыясненным, действуют ли эти факторы непосредственно на клетки или опосредованно через неидентифицированные компоненты сыворотки. Задачей заявляемого способа является получение активно пролиферирующей, жизнеспособной перевиваемой клеточной линии нейробластомы -32 в синтетической среде без содержания телячьей сыворотки. 12585 1 2009.10.30 Поставленная задача достигается тем, что предложен способ культивирования перевиваемой клеточной линии нейробластомы -32 в синтетической питательной среде, содержащей биологически активное соединение, в атмосфере с 5 -ным содержанием С 2 при 37 С и 90 -ной влажности, при этом в качестве биологически активного соединения среда содержит пируваткиназу в концентрации 10-11-10-7 М. Пируваткиназа (ЕС 2.7.1.40) - фермент гликолиза, катализирующий перенос высокоэнергетической фосфатной группы от фосфоенолпирувата на АДФ с образованием пирувата и АТФ. Существуют, по меньшей мере, четыре изозима пируваткиназы у позвоночных, определенных как , 1, 2, . Они отличаются по своим химическим, физическим,кинетическим, иммунологическим свойствам, а также по распределению в тканях 2. Введение пируваткиназы в концентрации 10-11-10-7 моль позволяет поддерживать пролиферацию и жизнедеятельность перевиваемой клеточной линии нейробластомы -32. Пример 1. Суспензию клеток перевиваемой клеточной линии нейробластомы -32 плотностью 2,0-3,0104 клеток/см 2 высевают на пластиковые или стеклянные чашки Петри в 10 мл модифицированной среды Иглас добавлением 10-11 пируваткиназы и культивируют в СО 2-инкубаторе в атмосфере с 5 -ным содержанием СО 2 и 90 -ной влажностью при температуре 37 С. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева при помощи микроскопа, жизнеспособность определяют по исключению красителя трипанового синего (данный краситель способны накапливать только погибшие клетки) 3. В качестве контроля используют культуры, которые выращивают в синтетической питательной среде в отсутствие фетальной сыворотки (контроль ) и культуры, которые выращивают в присутствии 10-11 М плазминогена (контроль ). Через 24 ч культивирования жизнеспособность и количество клеток нейробластомы,которые культивируют в бессывороточной среде, и эти же параметры для клеток, которые выращивают с добавкой пируваткиназы и плазминогена, не различались. Через трое суток число клеток в культурах нейробластомы, которые культивируют в присутствии пируваткиназы, увеличилось в 2,3 раза в сравнении с контролем , а концентрация клеток в чашках, в которые был добавлен плазминоген, возросла в 1,4 раза. В контролеколичество жизнеспособных клеток составило всего 35 . Жизнеспособность клеток в контролеи в присутствии пируваткиназы в концентрации 10-11 М составила 80 . Пример 2. Суспензию клеток перевиваемой клеточной линии нейробластомы -32 плотностью 2,0-3,0104 клеток/см 2 высевают на пластиковые или стеклянные чашки Петри в 10 мл модифицированной среде Иглас добавлением 10-7 М пируваткиназы и культивируют в стандартных условиях в С 2-инкубаторе в атмосфере с 5 -ным содержанием СО 2 и 90 -ной влажностью при температуре 37 С. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева при помощи микроскопа, жизнеспособность определяют по исключению красителя трипанового синего 3. В качестве контроля используют культуры, которые выращивают в синтетической питательной среде в отсутствие фетальной сыворотки (контроль ) и культуры, которые выращивают в присутствии 10-7 М плазминогена (контроль ). Через 24 ч инкубации количество клеток нейробластомы, которые инкубировали с пируваткиназой, увеличилось в 1,27 раза в сравнении с контролем. В культурах -32, которые культивировали в присутствии плазминогена, число клеток не отличалось от контроля. В этот период погибшие клетки отсутствовали. Через 3 суток количество клеток нейробластомы -32 в присутствии 10-7 М пируваткиназы возрасло в 4,2 раза по сравнению с контролем . Добавка же плазминогена в среду культивирования способствовала увеличению числа клеток в 1,6 раза по сравнению с контролем . Жизнеспособность клеток в контролек этому времени снизилась до 35 , а в присутствии пируваткиназы и плазминогена количество жизнеспособных клеток достигало 98 . 12585 1 2009.10.30 Культивирование со сменой среды 1 раз в 3 суток продолжают до получения необходимого количества клеток. Для проведения исследований по изучению влияния различных факторов на культивируемые клетки культуральную среду меняют на такую же, но содержащую 10-11 М пируваткиназы (истощенная культуральная среда), и используют для экспериментов. Таким образом, достигаемый технический результат заявляемого способа заключается в следующем позволяет сохранять жизнеспособность клеток перевиваемой линии нейробластомы -32 при полном отсутствии сыворотки в среде культивирования, т.е. в среде, все компоненты которой идентифицированы. Клетки нейробластомы в присутствии пируваткиназы делятся более активно, чем в присутствии плазминогена, что позволяет в 1,6-2,6 раза сократить время, требуемое для наращивания необходимой для эксперимента клеточной массы. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3