Способ культивирования перевиваемой линии клеток млекопитающих

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(72) Авторы Лукащевич Владимир Сергеевич Лукащевич Ирина Борисов на Никандров Виталий Николаевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(57) Способ культивирования перевиваемой линии клеток млекопитающих, отличающийся тем, что клетки культивируют на питательной среде ВМЕМ с добавлением плазмино 1 о 7 гена в концентрации 10 -1 О молеи в атмосфере, содержащеи 5 СО 2 и 95 воздуха.Изобретение относится к физиологии, к разделу культивирования клеточных культур.Известен способ культивирования перевиваемых клеточных культур, заключающийся в том, что суспензию клеток плотностью 104-105 на 1-10 мл высевают на пластиковые или стеклянные со специальным покрытием чащки Петри в синтетической питательной среде, содержащей 10-15 телячьей, бычьей или лощадиной сыворотки или их смеси и культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2 и 95 воздуха. Через 3 суток количество клеток возрастает в 3-5 раз. Культивирование со сменой среды 1 раз в 3 суток продолжают до получения необходимого количества клеток. Для проведения исследований по изучению влияния различных факторов на культивируемые клетки культуральную среду меняют на такую же, но содержащую 0,5 сыворотку (истощенная культуральная среда) и используют для экспериментов 1 - прототип.Общими признаками заявляемого способа и прототипа является культивирование вышеуказанного количества клеток в синтетической питательной среде при 37 С в атмосфере 5 СО 2 и 95 воздуха.Однако способ-прототип не позволяет культивировать клетки в химически детерминированных условиях из-за содержания в культуральной среде неидентифицированных компонентов сыворотки, присутствие которых не позволяет достоверно исследовать влияние факторов различной природы на культивируемые клетки, т.к. остается непонятным, действуют ли эти факторы непосредственно на клетки или опосредованно через неидентифицированные компоненты сыворотки. Этот недостаток способа-прототипа устраняет предлагаемое изобретение.Задачей заявляемого Изобретения является получение активно жизнеспособных перевиваемых клеточных культур в химически детерминированных условиях.Поставленная задача достигается тем, что предложен способ культивирования перевиваемой линии клеток млекопитающих, когда клетки культивируют на питательной среде ВМЕМ с добавлением плазминогена в концентрации 10-10-107 молей в атмосфере, содержащей 5 СО 2 и 95 воздуха.Плазминоген-гликопротеин с ММ 85 кДа является одним из основных компонентов системы свертывания крови. Он секретируется и захватывается некоторыми клетками,инициируя каскад пострецепторных событий, приводящих к усилению клеточного деления. Этим можно объяснить его пролиферативное действие в концентрации 10) моля, то есть количестве, необходимом для высокоаффинного связывания с рецептором. При концентрации 107 моля его действие особенно выражено. Это связано с тем, что на эффект рецепторного связывания накладывается способность плазминогена изменять свойства мембраны. В случае культивирования перевиваемых клеток в присутствии сыворотки по способу-прототипу реально объяснить эффект усиления пролиферации не представляется возможным из-за множественности компонентов, входящих в ее состав.Суспензию клеток плотностью 104-105 на 1-10 мл высевают на пластиковые или стеклянные со специальным покрытием чащки Петри в модифицированной среде Игла(ВМЕМ), плазминоген в концентрации 107 моля и культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2 и 95 воздуха. Через 3 суток количество клеток возрастает в 5-8 раз. Пролиферативную активность клеток оценивают по методу меченых субстратов 2. Культивирование со сменой среды 1 раз в 3 суток продолжают до получения необходимого количества клеток. Для проведения исследований по изучению влияния различных факторов на культивируемые клетки культуральную среду меняют на такую же, но содержащую 10-10 моля плазминогена (истощенная культуральная среда) и используют для экспериментов. Жизнеспособность клеток оценивают микроскопически, после окрашивания трипановь 1 м синим 3.Таким образом, заявленный способ позволяет наращивать активно жизнеспособные перевиваемые клеточные культуры в химически детерминированной среде, что дает возможность их использовать в особо точных экспериментах по изучению влияния различных факторов на культивируемые клетки, и поднять достоверность научных исследований на новый уровень.1. Вап 1 ег 6., 6051111 К. Сипигйп Ыегуе Се 115 //А Вгабгогб Воо 1, Т 11 е М 1 Т Рге 55, Саш Ьгйбе, Маззаспизепз, 1991. - Р. 207-213 (прототип). 2. бегу 15., 6 ег 511 оп К.К., Шакзшап В.Н. // 1. Ехр. Мед. 1972. - Уо 1. 136. - Р. 128.3. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков // М. Мир, 1983. - С. 93-94.Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.