Способ культивирования нервной ткани новорожденного млекопитающего

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ НОВОРОЖДЕННОГО МЛЕКОПИТАЮЩЕГО(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Полукошко Елена Федоровна Никандров Виталий Николаевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ культивирования нервной ткани новорожденного млекопитающего, включающий механическое и ферментативное дезинтегрирование ткани ганглия на отдельные клетки с последующим нанесением полученной суспензии клеток на покрытое коллагеном покровное стекло и культивированием в синтетической питательной среде ,содержащей телячью эмбриональную сыворотку, отличающийся тем, что используют питательную среду, содержащую 10 телячьей сыворотки и дополнительно содержащую фактор роста нервов в концентрации 100 нг/мл и супероксиддисмутазу в концентрации 10-8-10-7 М. Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к культивированию диссоциированных нейронов симпатических ганглиев. Известен способ получения диссоциированной культуры нервной ткани для общебиологических исследований, а также для тестирования целого ряда нейротропных и других препаратов. Он заключается в том, что стерильно извлеченные из организма животного ганглии подвергают механическому и ферментативному дезинтегрированию на отдельные клетки, наносят полученную суспензию на покрытые коллагеном покровные стекла или пластиковые чашки Петри и выращивают их в синтетической питательной среде(,США), содержащей 10 телячьей эмбриональной сыворотки. Для лучшей выживаемости и дифференцировки ткани симпатических ганглиев в питательную среду добавляют фактор роста нервной ткани 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является механическое и ферментативное дезинтегрирование ганглия и культивирование нервных клеток путем использования синтетической питательной среды и добавления к ней биологически активных веществ. Применяемая для получения культур телячья эмбриональная сыворотка, а 10290 1 2008.02.28 также фактор роста нервов позволяют получить зрелую, дифференцированную культуру ткани краниального шейного ганглия, однако недостаточно активно способствуют первоначальной адгезии клеток к субстрату. Однако получаемые по этому способу клетки характеризуются недостаточно активной первоначальной адгезией к субстрату, а также выживаемостью и последующей дифференцировкой нейронов. Задачей заявляемого способа является получение высокоорганизованной, дифференцированной культуры диссоциированных нейронов симпатических ганглиев, обладающих высокой адгезивной способностью и выживаемостью. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ культивирования нервной ткани новорожденных животных путем механического и ферментативного дезинтегрирования тканей ганглия на отдельные клетки с последующим нанесением полученной суспензии на покрытые коллагеном покровные стекла и выращиванием их в синтетической питательной среде ДМЕМ, содержащей 10 телячьей эмбриональной сыворотки и фактор роста нервов, причем в синтетическую питательную среду дополнительно вводят супероксиддисмутазу в концентрации 10-7-10-8 Моля (М). Супероксиддисмутаза (СОД,2-2- оксидоредуктаза, КФ 1.15.1.1) - энзим, катализирующий реакцию диспропорционирования супероксидного радикала с образованием перекиси водорода, играет важную роль в защите клетки от токсического действия избытка радикалов кислорода. Используемая эритроцитарная дисмутаза является С, -содержащим белком 2. Введение ее в питательную среду позволяет получить высокоорганизованные более зрелые культуры диссоциированных нейронов краниального шейного ганглия. Пример 1. Выделяют краниальный шейный ганглий и подвергают механическому и ферментативному дезинтегрированию на отдельные клетки, наносят полученную суспензию на покрытые коллагеном покровные стекла или пластиковые чашки Петри и выращивают их в синтетической питательной среде , содержащей 10 телячьей эмбриональной сыворотки и 100 нг/мл фактора роста нервов. В культуральную жидкость культуры ткани краниального шейного ганглия новорожденной крысы вносят асептически стерильно приготовленный раствор СОД в концентрации 10-7 М. С помощью светового микроскопа в 10 полях культуры спустя 1 сутки от начала культивирования визуально учитывают число прикрепившихся к коллагену нейронов, а также количество нервных клеток, пустивших отростки. До добавления ФРН (контроль) в 8 полях наблюдали по 10-15 прикрепившихся к коллагену клеток, 5-7 из которых выпускают отростки (нейриты). После внесения ФРНСОД (опыт) в 8 полях наблюдали 20-25 прикрепившихся к коллагену клеток, 10-15 из которых выпускают отростки (нейриты). Пример 2. Выделяют ганглий и подвергают механическому и ферментативному дезинтегрированию на отдельные клетки, наносят полученную суспензию на покрытые коллагеном покровные стекла или пластиковые чашки Петри и выращивают их в синтетической питательной среде , содержащей 10 телячьей эмбриональной сыворотки и 100 нг/мл фактора роста нервов. В культуральную жидкость культуры ткани краниального шейного ганглия новорожденной крысы вносят асептически стерильно приготовленный раствор СОД в концентрации 10-8 М. С помощью светового микроскопа в 8 полях культуры спустя 1 сутки от начала культивирования визуально учитывают число прикрепившихся к коллагену нейронов, а также количество нервных клеток, пустивших отростки. 2 10290 1 2008.02.28 До добавления ФРН (контроль) в 8 полях наблюдали по 10-15 прикрепившихся к коллагену клеток, 5-7 из которых выпускают отростки (нейриты). После внесения ФРНСОД (опыт) в 8 полях наблюдали 25-30 прикрепившихся к коллагену клеток, 15-20 из которых выпускают отростки (нейриты). Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет получить культуру ткани диссоциированного симпатического краниального шейного ганглия новорожденной крысы с повышенными адгезивными свойствами, что способствует последующему росту и дифференцировке клеток. Данный способ может найти широкое применение в экспериментальной клеточной биологии и медицине. Источники информации 1. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы. М., 1976. - С. 32-33 (прототип). 2. Фридович И. Свободные радикалы в биологии. - М. Мир. - С. 272-308. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.