Способ культивирования перевиваемой линии клеток млекопитающих

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(72) Авторы Гронская Раиса Ивановна Никандров Виталий Николаевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)Способ культивирования перевиваемой линии клеток млекопитающих, отличающийся тем, что клетки культивируют на питательной среде КРМ 1 1640 с добавлением стрептокиназы в концентрации 0,1-1000 МЕ/мл среды и тироксина в концентрации 16 нг/млсреды при температуре 37 С в атмосфере, содержащей 5 СО 2 и 95 воздуха.Изобретение относится к области медицины и биологии, разделу культивирования клеточных культур для медико-биологических и биологических исследований (например,процессов трансформации и дифференцировки клеток), а также для биотехнологических целей, в частности, для получения белковых и иной природы продуктов жизнедеятельности клеток.Известен способ культивирования перевиваемых линий клеток млекопитающих, заключающийся в том, что в синтетическую питательную среду добавляют 10-15 сыворотки крови млекопитающих (эмбриональную телячью сыворотку, ультрафильтрат бычьей сыворотки, сыворотку крови взрослой лошади) и культивируют в ней требуемую перевиваемую линию при температуре 37 С в атмосфере 5 СО 2 95 воздуха 1.Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому.Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является культивирование перевиваемых клеток млекопитающих в синтетической питательной среде при температуре 37 С в атмосфере 5 СО 2 95 воздуха.Однако способ-прототип не позволяет культивировать клетки в химически детерминированных условиях. Используемые для получения перевиваемых линий клеток млекопитающих сыворотки крови млекопитающих содержат собственные белки, что загрязняет культуральную жидкость и резко осложняет и удорожает выделение условных продуктов. Кроме того, недостаточная стандартность сывороток часто ведет к получению клеток пониженной жизнеспособности.Задачей заявляемого изобретения является получение устойчиво жизнеспособных культур клеток перевиваемь 1 х линий млекопитающих при одновременном исключении использования в инкубационной среде белков сыворотки крови.Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ культивирования перевиваемь 1 х линий клеток млекопитающих в синтетической питательной среде,содержащей биологически активную субстанцию при температуре 37 С в атмосфере 5 СО 2 95 воздуха в течение необходимого для эксперимента времени, отличающийся тем, что в качестве биологически активной субстанции в инкубационную среду добавляют стрептокиназу в концентрации 0,1-1000 МЕ/мл и тироксин в концентрации 16 нг/мл.Стрептокиназа - белок 45-55 кДа Б-гемолитических стрептококков группы С, являющихся сильнейщим активатором плазминогена.Тироксин (2,3,4,5-тетрайодтиронин) - гормон щитовидной железы. По химической природе являющийся производным тирозина и синтезируемый химическим путем.Введение в питательную среду стрептокиназь 1 и тироксина позволяет получать культуры перевиваемь 1 х линий клеток млекопитающих с высокой жизнеспособностью.Культура перевиваемь 1 х линий клеток млекопитающих - гомогенная популяция генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях. Клетки пассируют таким образом, что содержимое одного флакона или пластиковой чащки Петри распределяют между двумя новыми флаконами поровну.Контрольнь 1 ми вариантами служит синтетическая питательная среда (КРМ 1 1640) без добавок (К 1) и синтетическая питательная среда, в которую внесены 10 лощадиной и 5 эмбриональной телячьей сыворотки (К 2). В опытную среду вместо сыворотки крови вносят стрептокиназу в количестве 0,1 МЕ/мл и тироксин в количестве 16 нг/мл среды(Оп 1), стрептокиназу 1000 МЕ/мл и тироксин в количестве 16 нг/мл среды (Оп 2). Пассированнь 1 е клетки (равные по числу клеток флаконы) заливают по 7 мл соответствующих питательных сред (К 1 ,К 2, Оп 1 и Оп 2).Все культуры помещают в атмосферу 5 СО 2 95 воздуха при температуре 37 С. Рост и морфологию клеток учитывают на инвертированном микроскопе. Число клеток учитывают путем прямого подсчета в камере Горяева 2. При этом оценивают долю жизнеспособных клеток (неокращивающихся трипановым синим) 3. Значения количества клеток выражают в процентах. Количество клеток в контрольных культурах принимают за 100 . Достоверность различий количества клеток контроля и эксперимента оценивают с помощью г-критерия Стьюдента.При добавлении 15 сыворотки через 24 ч культивирования количество клеток увеличивается на 20 .При добавлении в питательную среду стрептокиназь 1 0,1 МЕ/мл и тироксина количество клеток уменьшилось на 66,67 (п 3, Р 0,05), гибель клеток составила 23,75При добавлении в питательную среду стрептокиназь 1 1000 МЕ/мл и тироксина количество клеток составило 97,5 от контроля (п 3, Р 0,05), гибель клеток составила 4,55Таким образом, заявляемый способ обладает следующими преимуществами замена сыворотки стрептокиназой и тироксином позволяет избегать вариабельности в количестве различных неиндентифицированных компонентов в инкубационной среде, что дает возможность иметь более объективные научные результаты.2. АдаМс Р. Методы Культуры Клеток для биохимиков. - М. Мир, 1983. - С. 93-94.3. Викторов И.В., Шунгская В.Е. Методы культивирования Руководство по культивированию нервной ткани. - М. Наука, 1988. - С. 34.Национальный Центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.