Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pRHW11 или pRHW12, кодирующей омега-интерферон

В этой области седиментирует специфическая для ос - и 51 -инте рферонов ЬШНК. мРНК из этой области градиентов концентрируется благодаря осаждению и растворению в воде.Составление библиотеки КДНК осу 5ществляют известныи методами. МРНК О снабжают добавкой олиготб 1. Затем благо даря добавкечетырех,дезоксинукпеозид трпфосфатов(6 АТР дСТР, астг, аттр)и фермента обратной транскрилтазы в 15соответственно буфернрованном растворе в течение 1 ч при 45 С синтезиру-. ют кДК. Благодаря экстракции хлороформом и хроматографии на колонкес гелем, например через сефадекс 050,20 очищают гибрид кДНК/мРНК. РНК гидро лизуют благодаря обработке щелочью(03 моль Ыа 0 Н при 5000, 1 ч), и КДНК после нейтрализации с помощью кислого раствора ацетата натрия осаждают этанолом. После добавки дезоксииуклеозидтрифосфатов и Е.со 11 дКполимеразы 1 в соответствующий раствор осуществляют двухнитевой(двойной) синтез, причем ДНК слупит ОДНОВРЕМЕННО как МЗТРИЦЗ И как затравка благодаря образовани структуры тиа шпильки на своем 3 конце (6 ч при 15 С). После экстракции фенолом,хроматографии на сефадексесбоъаосаж-ж дения этанолом ДНК впригодном растворе подвергают обработке специфической эндонуклеазой 5 1. При этом распадается структура шпильки, а так же непревращенная в двойную нить ДНК. После экстракции хлороформом и осаж дения этанолом двухнитевую ДНК 2(аз ДНК) разделяют по величине в сахарах с градиентом плотности. Для следующей стадии клонирования предпочтительно применяют только аз ДНК размером 600 Ьр и более, чтобы повыСИТЬ ВЕРОЯТНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ КЛОНОЕ, 25которые содержат комплектную кодируютщую последовательность новьм итерфронов. ее ДНК длинойболее 600 Ър концентрируют из градиентов путемДля того, чтобы увеличить образовавшиесн ее ЦНКмолекулы их нужно сначала внести в соответствующий вектор, а затем в бактери Е.со 11. Вектор представляет собой ппазмиду рВК322. Эта плазмида состоит из репликона и двух селекционных маркеров. Они придают хозяину резистентность против антибиотиков ампициллина и тетрациклина (Арт, Тер). Ген для Элактамааы(Ар)содержит последовательность для распознавания рестрикционной эндонуклеаэы Рас 1. рВВ 322 можно разрезать с помощьюР 5 с 1. Выступающие 3-концы удлиняются с помощью концевого фермента дезоксинуклеотидтрансфе разы (тат) при помещении СТР в соответственно буферированный раствор. Одновременно также на Зконцах удлиняется дв ДНК с помощью фермента ТТконцы плазмиды и да ДНК смешивают всоответствующих концентрационных соотношениях и при пригодных условиях температуры, солевых и буферных условиях..ргоА 2, 1 асЧ 3 а 1 К 2,грзЬ 12 О (шг), ху 1-5, шс 1, зирЕ 44, 1 ашЬаа) обрабатывают путем выращивания в СаС 1 д Компетентный Е. со 1 НВ 501 смешивают с ДНК и после инкубации при 0 С транст формируют полученной плазммдной ДНК путем теплового нагрева при 42 С в течение 2-мин. Затем трансформированные бактерии помещают на содержащие тетрациклинагаровые пластинки (10 мкг на 1 мл). На этом агаре могут расти только Е. со 11 НБ 101, которые восприняли векторную или рекомбинантную векторную молекулу (Тег), Рекомбинантные вектор-б 5 ДНК-молекулы передают хозяину генотип Ар 5 ТСр, так как благодаря введению ее ДНК в /3-лактамаэу ген разрушается информация для 3 пак тамазы. Клоны переносят на агароиые пластинки которые содержат 50 мкг/мл ампициллина. Растет только примерно 32, что означает, что.97 клонов сот держат вставку еДНК-молекулы. Из них 28600 клонов переносят индивидуальнов лунки (выемки) пластинок для мкч ротитрования которые содержат питательную среду, 10 мкг/мл тетрациклина и глицерина. после того, как клоны увеличиваются в них, пластинки хранит при -70 С (кДНКбиблиотека).Клоны после размораживания переносят на нитроцеллюлозные фильтры. Эти фильтры расположены на содержащем тетрациклин питательном агаре. Послеувеличения колоний бактерий ДНК бактерии фиксируют на фильтре.В качестве образца служит предпочтительно вставка клона рЕК 33 которая содержит ген для пытал-Ага. Благодаря никтрансляции этот кусок ДНК РЗДНОЗКТИВНО МЗРКИРУЮТ, ПРИЧЕМ применяется ДНК-полнмераза 1.АТР СТР ТТР исю 51 Р-ЗСТР. Нитроцеллюлоэные фильтры при пригодных нестрогих условиях гибридизации предварительно прежде всего обрабатывают без добавки радиоактивного образца и затем,гибридизируют примерно в течение 16 ч при добавке радиоактивного образца. После этого фильтры промывают также в нестрогих условиях. Благодаря низкой строгости (точности) гибридизации и промывки охватывают не только содержащие интерферонф 2 Аг 3-клоны, но также другие интерферонсодержащие клены, последовательности которых могут заметно отклоняться от последо 5вательностей до сих пор известного ин 25терферонаы. После высушивания фильтры экспонируют на рентгеновской пленке. Почернение которое четко нахо дится над уровнем фона, показываетналичие клона СО СПЕЦИФИЧЕСКИМИ интерферону последовательностями.Так как.сигналы радиоактивности ИМЕЮТ различное КЗЧЕСТВО. ТО ПОЛОЖИ ТВЛЬНЫЭ КЛОНЫ. подозреваемые как ПОЛО ЖИТЕЛЬНО реагирующие КЛ 0 НЫ выращивают в маленьком масштабе. Плазмидную ДНК-молекулы изолируют, переваривают с рестрикционной зондонуклеазой Рас 1 и разделяют по размеру электрофорети зочески на агаровом геле (геле агарозы) допо методу Саутерна переносят на нитроцеллюлозный фильтр. ДНК этого фильтра гибридиэируют с помощью радиоактив ного, содержащего ЕРЫ-ген денатуриро- 45ванного образца. В качестве положительного контроля служит плазмидасодержащая ген для.интерферона. ф 2 ага. Ауторадиограмма четко показывает 56последовательность, которая гнбридизируется при нестрогих условиях с помощью гена интерферона оЬ 2 А 3. Для того, чтобы подробнее охарактеризовать ее ДНК-вставку клона Е 76 Е 9 и клона Р 9 А 2 плазмды этих клонов при готовляют в большем масштабе. ДНК переваривают различными рестрнкциониымэндонуклеазами, например с А 1 о 1 Зап ЗА, вд 111, наш 1, Рас 1 и Нае 111. Образовавшиеся фрагменты разделяют в агаровом (агарозном) геле. Благодаря сравнению-с соответствующимм маркерам величин, напримерС фрагментами, которые образуются путем переваривания рВЕ 322 с рестрик Цнонной эидонуклеазойН 1 пЕ 1 соответственно Нае 111, определяют размеРЫФрагментов. Определяют последовательность этих фрагментов. Сделан вы ВОДд ЧТО В СЛУЧЗЕ ВСТЭВКИ КЛОН 0 В-используют для того, чтобы переварить кДНК-ставку с рестрикционными эндонуклеазами. Образовавшиеся фрагменты лнгируют в 65 ДНК-форму (репликатив УННЯ ФОРМЕ) М 13 шр 9 и секвенсируют спомощью дидеокси-метода 5 ап 3 ег. Однонитевуш ДНК рекомбинантных фагов ИзолирУют. После связывания синтетического олигомера в четырех отдельны приготовлениях осуществляют двухНИТЭВЫЕ СИНТЕЗЫ при применении БОЛЬшого фрагмента ДНК-полнмеразы 1 из Е.со 11 (Фрагмент Кленова). В каждой из четырех частичных реакций добавляют один из четырех дидезоксинуклеозидтрифосфатов (аактг ббСТР дастг дТТР). Это приводит к статистически распределенным обрывам Цепи в тек.местах, на которых в матрице ДНК нахо дится дополнительное к соответствующему дидезоксинуклеозидтрифосфату основание. Кроме того, дополнительно используют радиоактивно маркированный АТР. По окончании реакции синтеза Ь продукты денатурируют и однонитевьле ДНК-фрагменты разделяют по величинев денатурирующем полиакриламдном геле. После этого гель экспонируют на рентгеновской пленке. Из ауторадиограммы можно определить ДНК-последоВЗТЕЛЬНОСТЬ рекомбинаитногоМ 3 фага.рекомбинантныхаговопределяют с по мощью пригодной компьютерной програм ЬШЬИзолированная КДНК клона Е 76 ЕД дляомега (С 1 и)-интерферона длиной 858 пар оснований имеет 3-НетраНСлиро ванную область. Область, которая кодирует зрелый омега (С 1 и)-интерферонДОХОДПТ От нуклеотида 9 до нуклеотида 52 д. изолированная кДНК клонаДНКпоследовательностъ кодируюЩад Омега-Интерферон, полностью содержится в клонах Е 76 Е 9 И РЭА 2. Они начинаются на Ы-терминальном конце аминокислот цистеин-аспарагиноваякис 5 лота - лейцин. Оба зрелых омега-интерферона имеют длину 172 аминокислоты, что четко отклоняется от длин обоих известных интерферонов например 166 (соответственно 165).аминокислотга-интерферона обладают потенциальным участком Ы-гликозидирования в положенни 78 аминокислот (аспарагин-метиоНин-треоннн).Сравнение ДНК клона Е 76 Е 9 и клона РЭА 2 показывает различие. кодирующий аминокислоту 111 триплет в клоне Е 76 Е 9 представляет собой БАС И кодирует глутаммновую кислоту, в то время как этот триплет в клоне Р 9 А 2 представляет собой ССС и кодирует глицин. Оба омега-интерферон-протеина поэтому различаются одной амнокнслотой и обозначаются какомега (С 1 и)-интерферон (Е 67 Е 9) и омега (С 1 ц)-интерферон (РА 2).Ц 1 Сравнение обоих омета-интерферонов с до сих пор известным челове 1 ческим оз-интерфероном дает следую щую картину (см.таблицУ).ьы.ь- щ..., Длина протеи на в аминокислотах Потенциальное место Ы-гликози лирования в положенииИнтерферон альфа-А имеет только 165 аминокислот. Интерферон альфа-Н имеет потенциальное место для Ы-гликозилирования в положении 75.Е. со 11 НЕ 101 с плазммдой Е 76 Е 9 и Е. со 11 101 с плазмдой Р 9 А 2 депонированы (3.7.198 д) в немецкой коп лекции микроорганизмов (1 5 МС 5 45. с 1 п 5 еп) под номером ПБМ 3003, соответственно ПБМ 3004.дня доказательства того, что вновь найденные кланы продуцируют 50лизат бактерий после его роста испытывают в тесте сокращения пятна Однако гены Аэкспрессируются в плазмиде экспрессии рЕК 103, так как этот вектор содержит-все регуляционные элементы, которые приводят. к высокой скорости экспрессии клонированных генов. Согласно изобретению в плаэмиде рВК 322 более короткий ЕсоК 1/Ваш Н 1 фрагмент заменен ДНКпоследовательностью формулыТААССАССТТТААССТТААА 6 Атс ъте ввз н 1 па 111 Суэ1. Получение необходимых для этойЦЕЛИ Отдельных фрагментов ДНК. Фрагмент а.Для получения фрагмента а плазмыду, которая содержит ген для 1 РП-оме га, например плазмиду Р 9 А 2, перева Ча 1 СТС11 е Атс Мес АТС С 1 пСАА ССА САА ТСТ ССТ 125АСС АСС ТАСТТС САС ССА АТС ССТ СТС ТАС СТС ААА БАС ААС АААТут Бег Азр Суо А 1 а Тгр С 1 ц Ча 1 Ча 1 Ага Мес С 1 и 11 е Мес ЪузТАС АСС САС тот асс товМес Агд Ага 11 еАСС Ьоо СТС Ьец СТС10 1. Н 1 в С 1 у Ьец Ьец Бег Ага Азп ТЬг Ьеи СЫсо 1 САТ ССС СТА СТТ АССАСС ААС АСС ттс 28ССА АТТ АСС АСС ССТА Ат Тук Рне С 1 п С 1 у 11 е Агв Ча 1 Туг Ьец Ъув 61 ц Ьуз ЬузРНВаЮТс рестрикционной эндонуклеа зон Ача 11. После йроматографни и очистки полученной кдБквставки ее переваривают с рестрнкцнонными эндо нуклеаэами Ы со 1 и А 1 ц 1 двукратно н после этого изолируют с помощью хро матографии и эпектроэлюнрования. 3 Т 0 Тфрагментсодержитбольшуючастьсоответствующего омега-интерфероногена. Так, Например, омега (С 1 у)интерфроноген клона Р 9 А 2 имеет следующую структуру25 Бег Рго Рпе Ъеи Сузтсс сстттс ттс тот до С 1 п С 1 ц МесСАС САС АТС 55САС АСТ ССА СТТ САТСАС СТАСТС ОБА 298 120ОСА ста АСС 343САА стт стАсА АТС САА АТС АТС ААА А 33.Бег Ъец Рпе Ъец Бег Тъг Азп Мес 61 п С 1 ц Ага Ьец Агд Бег Ьузтсс ттс ттс ттдАвр Ага Азр Ьец С 1 у 5 ег БегТСА АСА ААС Атс САА САА АвА.стс АСА АСТ АААСАТ АСА САС СТС ССС ТСА ТСТ ТСАААТСАТТСТСАТСАТТААТТТСССАТА 530