Способ интрогрессии ценных генов от 1 ЕBN дикого диплоидного вида картофеля в геном картофеля вида Solanum tuberosum

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИНТРОГРЕССИИ ЦЕННЫХ ГЕНОВ ОТ 1 Е ДИКОГО ДИПЛОИДНОГО ВИДА КАРТОФЕЛЯ В ГЕНОМ КАРТОФЕЛЯ ВИДА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ермишин Александр Петрович Воронкова Елена Васильевна Полюхович Юлия Владимировна Маханько Ольга Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ интрогрессии ценных генов от 1 дикого диплоидного вида картофеля в геном картофеля вида, заключающийся в том, что получают линию картофеля, представляющую собой линию-посредник, способную скрещиваться с 1 диким диплоидным видом картофеля, путем скрещивания дикого диплоидного видас видомпри использовании видав качестве материнской формы, получения гибридов картофеля поколения 1, получения путем их самоопыления или сестринского скрещивания гибридов картофеля поколения 2 и отбора среди них гибрида картофеля с привнесенным от видааллелем генав гомозиготном состоянии, затем получают промежуточный гибрид 1 ди Фиг. 1 17468 1 2013.08.30 кого диплоидного вида картофеля с линией-посредником, при этом линию-посредник используют в качестве материнской формы, и скрещивают полученный промежуточный гибрид с картофелем вида, при этом картофель видаиспользуют в качестве опылителя. Изобретение относится к селекции растений, например картофеля,и может использоваться в сельском хозяйстве. В селекции растений, например картофеля, применяют метод отдаленной гибридизации между культурным картофелем и 1 диплоидными дикими видами картофеля, например,,,и др., с целью интрогрессии в селекционный материал ценных генов диких видов. 1 диплоидные дикие виды картофеля имеют диплоидный набор хромосом (2224), в отличие от культурного картофеля, который является автотетраплоидом (2448, 4 ). Поэтому для вовлечения их в гибридизацию с культурным картофелем целесообразно использовать дигаплоиды(2224, 2 ). Однако гибридизация между этими видами и дигаплоидамисильно затруднена из-за жестких межвидовых пре- и постзиготных репродуктивных барьеров. Известен способ получения гибридов между культурным картофелеми 1 дикими видами картофеля, основанный на проведении промежуточных скрещиваний ( ) для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров, 1994). Считается, что наряду с двумя несовместимыми видами, например диким видом и культурным картофелем, может быть третий вид картофеля (вид-посредник), который скрещивается с диким видом, а полученные гибриды можно непосредственно, или после изменения их плоидности, или через гибридизацию с очередным видом-посредником вовлечь в гибридизацию с культурным картофелем, что в итоге позволяет осуществить интрогрессию ценных генов дикого вида в селекционный материал. В качестве посредника для вовлечения в скрещивания дикого диплоидного вида картофеля .(2, 1 ) с .в этом способе использовали аллотетраплоидный (4, 2 ) вид . . У полученных триплоидных двухвидовых гибридов(-) удвоили число хромосом, затем гексаплоиды ..6 2 скрестили с видом-посредником .(2, 2 ), получив тетраплоидный гибрид 4 2, который можно было скрещивать с сортами культурного картофеля.(4, 4 ). Недостатки способа следующие. Из-за низкой эффективности гибридизации на всех этапах его осуществления требуется проведение большого объема скрещиваний. Длинная цепочка скрещиваний с посредниками и манипуляции с плоидностью гибридов занимают длительный период времени, удвоение плоидности гибридов связано с использованием сложных методов митотического удвоения хромосом. В результате эффективность метода оказалась невысокой было получено 36 четырехвидовых гибридных растений АВРТ от опыления, в общей сложности 18616 цветков. Наиболее близким техническим решением является способ получения гибридов между культурным картофелем .и 1 дикими видами картофеля, который основан на получении промежуточных гибридов с участием дикого диплоидного вида .(2224, 2 ), характерной особенностью которого является отсутствие пестичных -РНКаз , , 2009. Способ включает гибридизацию между образцами дикого диплоидного вида . , которые используют в качестве материнских форм, и мужски фертильными образцами 1 диких видов картофеля, которые используют в качестве опылителей. Полученные промежуточные гибриды беккроссируют дигаплоидами .или диплоидными межвидовыми гибридами, а затем дигаплоидами . . Для переноса интрогрессированных от 1 диких видов 2 17468 1 2013.08.30 картофеля ценных генов в селекционный материал .(2448) отобранные в беккроссных поколениях генотипы переводят на тетраплоидный уровень с помощью митотического или мейотического удвоения хромосом. Отсутствие пестичных -РНКаз у .позволяет решить проблему презиготной несовместимости, имеющей место между многими 1 дикими видами и 2 видами картофеля пыльца любого вида картофеля, в том числе 1 диких видов, способна беспрепятственно расти в пестиках . . Однако образование жизнеспособных гибридных семян затруднено из-за нарушения развития их эндосперма, обусловленного различиямиродительских видов. Тем не менее, можно предположить, что благодаря отсутствию презиготных барьеров в скрещиваниях между .(2 ) и 1 видами возможно завязывание небольшого количества семян вопреки правилу совпадения эффективной плоидности родительских видов. Этот способ имеет следующие недостатки. Завязываемость жизнеспособных семян при гибридизации между видом-посредником .и некоторыми 1 дикими видами картофеля, как правило, очень низкая. Так, с помощью описанного способа не были получены гибриды между .и одним из наиболее ценных для селекции диких видов картофеля . . Не удалось получить такие гибриды и.(2005), несмотря на большой объем скрещиваний и использование специальных приемов(культура гибридных зародышей). Полученные гибриды между .и 1 дикими видами картофеля практически не образуют клубни в условиях Беларуси,что затрудняет их беккроссирование дигаплоидами . . Эти гибриды с трудом скрещиваются с дигаплоидами .при использовании в качестве материнских форм из-за действия факторов презиготной несовместимости, полученных от 1 дикого вида (пестичных РНКаз 1 дикого вида). Мужски фертильные межвидовые гибриды не скрещиваются с дигаплоидами .при использовании в качестве опылителей по причине односторонней несовместимости (для успешной гибридизации требуются акцепторные формы . ). Если их удается беккроссировать дигаплоидами . , используя в качестве материнских форм, получается мужски стерильное потомство, что является результатом взаимодействия цитоплазмы .с ядерными генами .(ядерно-цитоплазматическая мужская стерильность). Это не позволяет использовать мейотическое удвоение хромосом для перевода беккроссов на тетраплоидный уровень (не образуется фертильная нередуцированная пыльца). Сущность изобретения состоит в решении задачи повышения эффективности гибридизации между посредником и 1 дикими видами картофеля и упрощения процедуры беккроссирования полученных гибридов дигаплоидами . . Решение задачи состоит в том, что получают линию картофеля, представляющую собой линию-посредник, способную скрещиваться с 1 диким диплоидным видом картофеля, путем скрещивания дикого диплоидного видас видомпри использовании видав качестве материнской формы, получения гибридов картофеля поколения 1, получения путем их самоопыления или сестринского скрещивания гибридов поколения 2 и отбора среди них гибрида картофеля с привнесенным от видааллелем генав гомозиготном состоянии,затем получают промежуточный гибрид 1 дикого диплоидного вида картофеля с линией-посредником, при этом линию-посредник используют в качестве материнской формы, и скрещивают полученный промежуточный гибрид с картофелем вида, при этом картофель видаиспользуют в качестве опылителя. У картофеля презиготные барьеры ассоциируют с функционированием так называемого -локуса (локализован на хромосоме ). Результат гибридизации как внутривидовой,так и межвидовой, определяется взаимодействием продуктов пестичного и пыльцевого компонентов -локуса. Продуктами пестичного компонента -локуса являются -РНКазы,которые содержатся в пестиках вне зависимости от факта опыления, могут свободно про 3 17468 1 2013.08.30 никать в цитоплазму пыльцевых трубок и, действуя как ингибитор процесса трансляции,останавливать их рост. Этот своеобразный барьер могут преодолеть лишь те пыльцевые трубки, которые содержат определенные продукты, способные дезактивировать соответствующие РНКазы. В качестве кандидатов в продукты пыльцевого компонента -локуса рассматривают так называемые -протеины (-), которые могут узнавать соответствующие -РНКазы и запускать систему деградации -РНКаз. Есть основания полагать, что межвидовая несовместимость у картофеля обусловлена тем, что процесс взаимодействия пыльцевого и пестичного компонентов -локуса при гибридизации отдаленных в эволюционном отношении видов нарушен, поскольку дезактивация соответствующих пестичных РНКаз может произойти только с помощью протеинов того же или близкородственного вида. 1 диплоидные виды картофеля,многие из которых произрастают в Мексике, - группа наиболее древних с точки зрения эволюции клубненосных видов . Поэтому неслучайно, что для многих 1 диплоидных видов картофеля характерна высокая степень выраженности презиготных барьеров несовместимости при гибридизации их с дигаплоидами . . Особенно это относится к ценному для селекции виду картофеля . , при гибридизации которого с дигаплоидами .имеет место полное ингибирование пыльцы в пестиках вне зависимости от использования разных генотипов компонентов скрещивания Маханько, 2008. Постзиготными считаются барьеры, возникающие после проникновения пыльцевых трубок в завязь и оплодотворения. Прежде всего, они обусловлены гибелью зародышей вследствие недоразвития эндосперма и связаны с понятием(балансовое число эндосперма) вида. Каждому виду картофеля предписывается определенный специфический показатель (его ), значение которого определяет поведение этого вида (формирование эндосперма гибридных семян) при гибридизации с другими видами. Для успешной гибридизацииродительских форм должны совпадать, чтобы эндосперм, а следовательно, и семя развивались нормально.вида может быть не равен его плоидности, оно является мерилом его эффективной плоидности. Для каждого вида определена его эффективная плоидность, что позволило сгруппировать виды по группам скрещивания - 2(1 ),2(2 ), 3(2 ), 4(2 ), 4(4 ) и 6(4 ) , 1999. Благодаря наличию в гомозиготном состоянии . генов , привнесенных от. , -линии не образуют пестичных РНКаз. Поэтому они, так же как и .не имеют презиготных барьеров в скрещиваниях с 1 дикими видами картофеля при использовании их в качестве материнских форм. Соответственно, в таких скрещиваниях возможно завязывание небольшого количества гибридных семян вопреки правилу совпадения эффективной плоидности родительских форм. По сравнению с .растения -линий отличаются культурным типом куста, большей мощностью,цветут более интенсивно и продолжительно, способны завязывать больше гибридных семян, способны формировать клубни в условиях Беларуси. Промежуточные гибриды между -линиями и 1 дикими видами картофеля в качестве одного из родителей (-линии) имеют относительно культурную форму. Благодаря этому они лучше приспособлены к климатическим условиям Беларуси (умеренные широты, длинный летний день), в силу чего обладают более высокой способностью к клубнеобразованию. Они несут большее количество признаков культурного картофеля и меньшее количество нежелательных для селекции признаков дикого вида, чем растения. . Поэтому требуется меньше поколений беккросса дигаплоидами .промежуточных гибридов между 1 дикими видами картофеля и посредником, чтобы усилить культурные признаки и избавиться от нежелательных признаков дикого вида. Это свойство -линий может быть усилено в ходе последующей селекции,включающей их беккроссирование дигаплоидами .в сочетании с отбором гомозигот . Гибриды между -линиями и 1 дикими видами картофеля более 4 17468 1 2013.08.30 мощные, чем гибриды между .и 1 дикими видами картофеля. Они цветут более обильно и в течение более длительного времени, что упрощает процедуру их беккроссирования дигаплоидами . . Растения промежуточных гибридов между посредником (-линией или. ) имеют следующее строение -локуса д.в., где- аллель -гена от, а д.в. - аллель -гена от 1 дикого вида, использованного в качестве опылителя. Соответственно, в пестиках таких гибридов будет образовываться -РНКаза дикого вида (аллельот .является нефункционирующим). В силу гемизиготности активность пестичной РНКазы у гибридов ниже, чем у родительского дикого вида,поэтому презиготные барьеры при беккроссировании промежуточных гибридов дигаплоидами .выражены не так сильно, как при гибридизации непосредственно между дигаплоидами .и 1 дикими видами картофеля. В результате возможно получение семян первого поколения беккросса (1) при использовании промежуточных гибридов в качестве материнских форм. Получение последующих поколений беккросса культурным картофелем значительно упрощается в силу того, что среди ВС 1 резко уменьшается доля генотипов с аллелем д.в., то есть образующих -РНКазы дикого вида. Промежуточные гибриды и их беккроссное потомство на основе -линий имеют цитоплазму . , что обеспечивает их мужскую фертильность. В то же время практически все гибриды между .и дигаплоидами .мужски стерильны (ядерно-цитоплазматическая мужская стерильность) , , 1972. Мужская фертильность промежуточных гибридов и их беккроссного поколения благодаря наличию у них цитоплазмы .делает возможным использование мейотического удвоения хромосом у беккроссов для перевода их на тетраплоидный уровень с помощью мейотического удвоения хромосом, которое считается более простым и эффективным по сравнению с митотическим удвоением хромосом. Присутствие в пестиках промежуточных гибридов -РНКазы дикого родительского вида может существенно снизить завязываемость семян при их беккроссировании дигаплоидами . , поскольку -локус последних не кодирует образование ингибиторов РНКаз, способных дезактивировать -РНКазы дикого родительского вида. Возможность использовать промежуточные гибриды в качестве опылителей позволяет решить проблему презиготной несовместимости с дигаплоидами . , поскольку в пыльце гибридов в силу расщепления по 8-локусу будут пыльцевые зерна, несущие как аллель д.в.,так и . Пыльцевые зерна с аллелем , как известно, кодируют ингибиторы -РНКаз,способные дезактивировать -РНКазы, находящиеся в пестиках дигаплоидов . ,относящихся к акцепторным генотипам по отношению к .(способным опыляться . ). 1974. Однако в распоряжении исследователей не всегда имеются акцепторные генотипы . . Проблему беккроссирования промежуточных гибридов дигаплоидами .можно легко решить, если опылить пыльцой фертильных промежуточных гибридов материнские формы -линий. Половина потомства от таких скрещиваний будет гомозиготами , которые в силу отсутствия у них в пестиках -РНКаз будут гарантированно скрещиваться с дигаплоидами . . Тот же результат достигается при опылении материнских форм .фертильной пыльцой промежуточных гибридов. Однако в этом случае потомство будет иметь значительно большую долю генома, полученную от диких видов, в связи с чем потребуется больше беккроссов культурным картофелем по сравнению с вариантом использования -линий. Кроме того, беккроссное потомство на цитоплазме .будет мужски стерильным. Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что используют в качестве посредника вместо образцов .специально созданные -линии. Это дает возможность повысить по сравнению с прототипом эффективность гибридизации между посредником и 1 дикими 5 17468 1 2013.08.30 видами картофеля. Более высокая жизнеспособность, интенсивность цветения и способность к клубнеобразованию промежуточных гибридов между посредником и 1 дикими видами картофеля позволяет упростить процедуру и уменьшить продолжительность их беккроссирования дигаплоидами . . Использование -линий в качестве материнских форм при опылении их фертильной пыльцой промежуточных гибридов позволяет получать мужски фертильное потомство, которое легко скрещивается с дигаплоидами . . Это значительно упрощает процедуру беккроссирования промежуточных гибридов дигаплоидами .и делает возможным использование мейотического удвоения хромосом у беккроссов для перевода их на тетраплоидный уровень. Фиг. 1 представляет схему создания -линий. Фиг. 2 представляет результаты гибридизации между рядом образцов .и 1 дикими видами картофеля. Фиг. 3 представляет результаты гибридизации между рядом -линий и 1 дикими видами картофеля, из которой видно, что завязываемость гибридных семян при использовании в качестве материнских форм -линий выше, чем при использовании .. Фиг. 4 представляет результаты оценки всхожести семян, клубнеобразования и фертильности пыльцы у гибридов 1 между .и 1 дикими видами картофеля и гибридов 1 между -линиями и 1 дикими видами картофеля. Эти результаты свидетельствует о более высокой по сравнению с прототипом всхожести семян, способности к клубнеобразованию и массе клубней с растения гибридов 1 между -линиями и 1 дикими видами картофеля. Среди этих гибридов достоверно меньше стерильных и низкофертильных генотипов и больше генотипов со средней и высокой функциональной фертильностью пыльцы. Фиг. 5 представляет результаты беккроссирования дигаплоидами .гибридов 1 между .и 1 дикими видами картофеля, из которой видно, что гибриды на основе -линий не уступают гибридам на основе .по способности скрещиваться в качестве материнских форм с дигаплоидами . . Предлагаемый способ интрогрессии ценных генов от 1 дикого диплоидного вида картофеля в геном картофеля видареализован следующим образом. Создание -линий. В качестве исходного материала использовали 29 образцов самосовместимого дикого диплоидного вида. (2224), семена которых были получены из Национального генного банка по картофелю США (-6). Эти образцы использовали в скрещиваниях в качестве опылителей с 13 фертильными вторичными дигаплоидами картофеля., 28 первичными дигаплоидами сортов Ласунак,Орбита, Альпинист (Беларусь), , ,(Мексика),(Польша),(Германия),(Нидерланды) из коллекции лаборатории генетики картофеля Института генетики и цитологии НАН Беларуси. Гибридизацию между дигаплоидамии образцамипроводили следующим образом. Для проведения гибридизации растения высаживали в грунт оранжереи из культурыили путем посева семян в начале мая. Растения высаживали рядами расстояние между рядами 70 см, между растениями в ряду 50 см. Режим выращивания растений температура воздуха 20-25 С - днем, 15-20 С - ночью, влажность 70 , освещение естественное. Для стимуляции цветения растения, достигшие высоты 35-40 см, подвязывали к кольям,обнажали от почвы место отхождения корней от стебля. Образующиеся столоны обрывали или оставляли над поверхностью почвы. Для получения -линий растения дигаплоидовиспользовали в качестве материнских форм. Накануне опыления проводили кастрацию бутонов, начинающих приобретать окраску (нижняя часть бутонов в это время имеет белый цвет, верхняя часть бутонов - цвет, характерный для цветков опыляемого образца), путем удаления 6 17468 1 2013.08.30 пыльников с помощью пинцета. Также удаляли в соцветии все раскрытые цветки, полураскрытые и незрелые (зеленые или начинающие приобретать беловатую окраску) бутоны. Образцыиспользовали в качестве опылителей. Сбор пыльцы проводили следующим образом распустившиеся цветы собирали, подсушивали 1 сутки при комнатной температуре, затем вытряхивали из них пыльцу с помощью электрического вибратора, например, электробритвы типа Микма 100, 101, Эра и др. Собранную пыльцу переносили в лунки пластмассовых планшетов, применяемых для иммуноферментного анализа или пластиковые одноразовые чашки Петри диаметром 5 см. Опыление кастрированных цветков дигаплоидовосуществляли путем погружения рыльца пестика в пыльцу. Использовали свежесобранную пыльцу или пыльцу, хранившуюся в морозильной камере при температуре - 10 С не более 5 дней. На опыленное соцветие вешали этикетку, в которой была указана дата опыления и наименование родительских форм. Применяли опыление смесью пыльцы или опыление пыльцой отдельных генотипов(при опылении смесью пыльцы завязываемость семян значительно выше). Смесь пыльцы готовили непосредственно перед гибридизацией путем объединения и тщательного перемешивания в лунке равных объемов пыльцы разных образцов. Пыльцевые трубки самосовместимогоне способны расти в пестиках самонесовместимых видов, в том числе дигаплоидов(односторонняя несовместимость). Тем не менее, обнаружены отдельные, так называемые акцепторные,генотипы дигаплоидов, которые могут завязывать семена при опылении. Показано, что акцепторностьнаходится под контролем двух генов гена акцепторностии ингибитора акцепторности(акцепторными являются генотипы )., 1974 (фиг. 1). В результате проведенной гибридизации между дигаплоидамиив изученной коллекции были обнаружены 4 акцепторных генотипа 1)98/109-5 первичный дигаплоид сорта(Мексика) 2) гибрид 881-28 (1.2-203/5.7)1.21.2 3) гибрид 895-40 (1.2203/5.7)1.2.2 4) гибрид 885-21 (1.2203/5.7 -20)1.215, где 1.2 - клон от свободного опыления первичного дигаплоида сорта Юбель, -203/5.7 вторичный дигаплоид на основе сорта Полесский розовый), А 15 - клон . . Через месяц после опыления на завязавшиеся ягоды надевали марлевые мешочки и подвязывали их к стеблю материнского растения. Гибридные семена извлекали из созревших ягод с помощью скальпеля или пинцета, подсушивали и хранили в бумажных пакетах при комнатной температуре. Для посева их замачивали на сутки в 0,1 растворе гиббереллина и высевали в начале апреля в плошки с торфяной почвой Двина, смоченной водой. Глубина заделки семян в почву 0,5 см. Растения гибридов 1 между акцепторными дигаплоидами .и .самоопыляли или проводили сестринские скрещивания (между разными растениями одной и той же гибридной комбинации) для получения гибридов 2. Целью получения поколения 2 является отбор гибридов, имеющих аллельв гомозиготном состоянии. Для большинства гибридов 1 была характерна высокая функциональная фертильность пыльцы, что обеспечило высокую результативность гибридизации с целью получения 2. Для дигаплоидов .характерна гаметофитная самонесовместимость. Тем не менее, среди них можно отобрать отдельные мутантные формы, способные к самоопылению. В настоящей работе в качестве материнских форм для получения гибридов с .использовано потомство самосовместимых дигаплоидов . , которые были отобраны нами ранее. Неслучайно поэтому отдельные гибриды 1 .Ч .оказались способными с высокой эффективностью завязывать семена при самоопылении. Те гибриды 1, которые были самонесовместимы, несложно было вовлечь в гибридизацию с сестринским формами достаточно различие по одному из 7-аллелей родительских форм, чтобы гибридизация была успешной. Семена, полученные в результате самоопыления гибридов 1, собирали и хранили, как описано выше. Их высевали на следующий год для получения растений 2, среди которых проводили отбор гомозигот (-линий). Для выделения -гомозигот проводили отбор по данным анализа роста в пестиках гибридов пыльцевых трубок мексиканских видов .и . , несовместимых с . . Наблюдение за ростом пыльцевых трубок в пестиках осуществляли по методике, описанной в руководстве Абрамовой с соавторами (1981) с помощью люминесцентного микроскопа Люмам И-3. Пестики опыленных цветков (3-5 штук от каждой комбинации скрещивания) собирали через 48 часов после опыления и фиксировали в ацетоалкоголе (31). При приготовлении препаратов растительный материал дважды отмывался от фиксатора в дистиллированной воде, затем выдерживался в течение 20 минут в 10 спиртовом растворе КОН и окрашивался далее в растворе красителя анилинового синего (0,1 раствор анилинового синего в 0,05 24, 12), после чего приготавливались давленые препараты в 50 водном растворе глицерина. Рост пыльцевых трубок оценивали в баллах 0 - ингибирование роста пыльцевых трубок непосредственно под рыльцем пестика, 1 - ингибирование роста пыльцевых трубок в верхней трети пестика, 2 - ингибирование на уровне середины-нижней трети пестика, 3 завязи достигает 1-5 пыльцевых трубок, 4 - завязи достигает 15-30 пыльцевых трубок, 5 завязи достигает толстый жгут пыльцевых трубок. В качестве -линий рассматривали растения, которые имели показатель роста пыльцевых трубок мексиканских видов, равный пяти баллам. Подобную картину можно наблюдать при опылении такой пыльцой . , для которого характерно отсутствие пестичных -РНКаз. Отобранные -линии непосредственно включали в гибридизацию с 1 дикими видами картофеля, либо получали клубни, из которых на следующий год выращивали растения -линий для гибридизации с 1 дикими видами картофеля или дигаплоидами .(для дальнейшего беккроссирования). Получение промежуточных гибридов между посредником и 1 дикими видами картофеля. Для вовлечения в гибридизацию с целью переноса в селекционный материал ценных генов от 1 диких видов картофеля проводили их гибридизацию разными образцами.(прототип) и отобранными -линиями (заявляемое решение). В качестве материала использовали 12 образцов .и 13 -линий (2 .. ) (материнские формы), которые скрещивали с мужски фертильными образцами диплоидных 1 видов картофеля . , . , . . Семена образцов диких видов были получены из Национального генного банка по картофелю США (-6) .190170,195171,195172,275256,275257,310966,498010,570643,570644,570645,545745,498060 .275231-275236, 537023 .230480, 275238, 347770,498036 .243505, 243506, 243512, 243513, 255516, 275191,275192, 498011. Выращивание растений и гибридизацию проводили, как описано выше, в 2009 г. В 2010 г семена полученных гибридов высевали, как описано выше, при этом учитывали всхожесть семян (количество взошедших семян/количество высеянных семян 100 ). У гибридных растений определяли показатели фертильности способность к цветению, образование пыльцы и функциональную фертильность пыльцы. Для определения функциональной фертильности пыльцы (далее ФФП) проводили проращивание пыльцыпо методике висячей капли, предложенной .. (1984). Для проращивания пыльцы готовили среду следующего состава 17468 1 2013.08.30 сахароза - 200 г/л,33 - 100 мг/л,(3)242 - 300 мг/л,472 - 200 мг/л,3 - 100 мг/л 5,5. По 3-5 капель среды (5 мкл каждая) наносились на поверхность влажных камер для проращивания. Пыльца равномерно распределялась по поверхности капель препаровальной иглой и выдерживалась 2-3 часа при комнатной температуре. После чего производился подсчет проросших пыльцевых зерен. Учитывали по 300 пыльцевых зерен с образца в нескольких полях зрения микроскопа (увеличение 600 Ч). Функциональную фертильность пыльцы рассчитывали как ФФПчастота проросших пыльцевых зерен/частота окрашенных пыльцевых зерен Ч 100 . В группу стерильных и низкофертильных гибридов относили те, которые не цвели, не образовывали пыльцу или имели ФФП ниже 5 . В группу среднефертильных относили генотипы, имеющие ФФП от 5 до 10 , а к высокофертильным относили генотипы с ФФП более 10 . Скрещивания промежуточных гибридов с дигаплоидами .проводили, как описано выше. Опыление гибридов проводили смесью пыльцы фертильных дигаплоидов .1) 881-10 - клон 10 комбинации скрещивания 1.2(1.2-203/5.7-20) -515 2) 882-5 - клон 5 комбинации скрещивания 1.2(1.2-203/5.7-20) -5 А 15 3) 883-6 - клон 6 комбинации скрещивания (1.2-203/5.7-29)-5 А 15 4) 895-40 - клон 40 комбинации скрещивания 1.2(1.2-203/5.7-20) -51.2, где 1.2 - клон от свободного опыления первичного дигаплоида сорта Юбель, -203/5.7 - клон от самоопыления вторичного дигаплоида 203/5.7 (вторичный дигаплоид на основе сорта Полесский розовый), 15- . . При уборке учитывали у промежуточных гибридов показатели клубнеобразования способность к клубнеобразованию - количество растений с клубнями/общее количество растений Ч 100 , а также массу клубней с растения (г). Источники информации 1.,. /( , .) -., . , 1994. - . 515-539. 2., 2009... - . 56(8). - . 1107-1116. 3. Маханько О.В. Межвидовая несовместимость в диплоидной селекции картофеля // Земляробстваахова раслн. - 2008. -1. - С. 11-14. 4. .//. - 1999. - . 42,. - . 283-312. 5.,// . - 1972. - . 21. - . 209-220. 6.,.,.,.-//. - 1974. - . 37-40. 7. Абрамова Л.И., Орлова И.Н., Вишнякова М.А., Константинова Л.Н., Орел Л.И.,Огородникова В.Ф. Методические указания по цитологической и цитоэмбриологической технике (для исследования культурных растений). - Ленинград ВИР, 1981. - 118 с. 8..,.,.//.. 28. . . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 11