Способ определения вида подорлика

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА ПОДОРЛИКА(71) Заявители Государственное научно-производственное объединение Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по биоресурсам Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Аксенова Елена Анатольевна Шимкевич Андрей Михайлович Домбровский Валерий Чеславович Никифоров Михаил Ефимович Давыденко Олег Георгиевич(73) Патентообладатели Государственное научно-производственное объединение Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по биоресурсам Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56) АКСЕНОВА Е.А. и др. Изучение и охрана большого и малого подорликов в Северной Евразии Материалымеждународной конференции по хищным птицам Северной Евразии. - Иваново, 2008. - С. 18-25.. // . - 2004. . 145. - . 256-263.. //. - 2005. - . 35. . 147-164.(57) Способ определения вида подорлика, заключающийся в том, что выделяют митохондриальную ДНК исследуемого подорлика и проводят ПЦР-ПДРФ анализ, в котором используют прямой праймер 53 и обратный праймер 53, полученные ампликоны обрабатывают эндонуклеазойи при детекции фрагмента длиной 317 п.о. вид подорлика определяют как, а при детекции фрагментов длиной 203 и 114 п.о. - как. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в популяционных исследованиях редких биологических видов. Известны способы генетических популяционных исследований, где в качестве генетических маркеров используют морфологические (фенотипические) признаки 1. Однако количество информативных маркеров этого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды. Развитие молекулярно-генетических методов анализа, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволило разработать новые маркерные системы, обеспечивающие определение генотипов биологических организмов непосредственно на уровне генетического материала клетки (на уровне ДНК), сократить время анализа и повысить его точность. 15244 1 2011.12.30 Большой и малый подорлики являются близкородственными видами, дивергенция которых произошла около 1 млн. лет назад. В Беларуси ареалы обоих видов полностью перекрываются. Морфологически эти виды очень сходны и, по мнению многих исследователей, различение малого и большого подорлика в полевых условиях представляет большую сложность, а иногда практически невозможно. Диагностические признаки малого и большого подорликов до сих пор являются предметом научных дискуссий 2. В настоящее время в зоне перекрывания ареалов малого и большого подорликов, в Польше,Белоруссии и Прибалтике, отмечается высокая частота образования смешанных пар и появление гибридных птиц 3. Применение молекулярно-генетических методов для видовой диагностики позволяет избежать субъективных подходов и упрощает процедуру определения фенотипически близких видов. Исследователями используется несколько маркерных участков для филогенетических и популяционных исследований рода . Проводится сравнительное изучение как всей последовательности митохондриального генома, так и его различных районов генов цитохрома , субъединицдегидрогеназы, цитохром-оксидантного комплекса, генов тРНК, а также гипервариабельного районаД-петлии псевдовариабельного района 4. Для популяционных исследований также используются маркерные районы генома ядра, включающие в себя такие гены, как -1 кодирующий район белка активатора рекомбинации, третий интрон гена лактат дегидрогеназы , интроны гена аденилаткиназы, 7-й интрон гена -фибриногена 5. Молекулярно-генетический идентификационный анализ позволяет исследовать особые участки ДНК, строго специфичные для каждого индивидуума. В основном изучается первичная последовательность всех вышеперечисленных генов, что требует существенных затрат и соответствующего оборудования. Наиболее близким по технической сущности является способ оценки генетического потенциала КРС путем ДНК-тестирования (ПЦР-ПДРФ метод) генотипов животных по-маркеру гена пролактина и -маркеру гена гормона роста и выявлении сопряженных генотипов по локусам пролактина и гормона роста, определяющих повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке, согласно разработанному перечню генотипов. Способ позволяет осуществлять подбор пар в селекционной работе по улучшению молочных пород 6. Задача изобретения - создание эффективного и недорогого способа идентификации таких родственных биологических видов, какими являютсяи. Поставленная задача решается предлагаемым способом видовой идентификации большого подорликаи малого подорлика, путем ПЦР-ПДРФ анализа района гена цитохромамитохондриальной ДНК. ПЦР-ПДРФ анализ района гена цитохромамитохондриальной ДНК, предусматривающий выделение ДНК исследуемого организма, проведение полимеразной цепной реакции с использованием праймеров к данному локусу прямой 53 и обратный 53 с последующей эндонуклеазной обработкой ферментом(, Литва). Видовую принадлежность исследуемых организмов определяют путем сравнения полиморфизма длин рестрикционных фрагменов. Фрагмент амплификации длиной 317 п.о. содержал сайт узнавания эндонуклеазойу вида, и детектировались фрагменты длиной 203 и 114 п.о. Тогда как для видапосле эндонуклеазной обработкисохранялся фрагмент длиной 317 п.о. (фиг. 1). Способ осуществляют следующим образом. Способ основан на ПЦР с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ) и включает в себя выделение ДНК из образцов биологи 2 15244 1 2011.12.30 ческого материала, ПЦР-ПДРФ анализ, предусматривающий амплификацию локуса геномной ДНК митохондрий при помощи разработанных ДНК-праймеров. Реакционная смесь для амплификации объемом 15 мкл содержала 1 ПЦР-буфер фирмы Дилат (г. Москва) по 0,25 каждого из 2,52 по 5 / прямого и обратного праймеров, 1 ДНК-полимеразы (Диалат), 1 мкл ДНК. Полимеразная цепная реакция проводилась на амплификаторах 2700 () и. Амплификация проводилась при следующих условиях предварительная денатурация 94 - 3 мин, затем 35 циклов 94 - 20 сек, 58 - 20 сек, 72 40 сек и заключительная элонгация при 72 - 4 мин. После ПЦР-реакции полученные ампликоны подвергались обработке эндонуклеазойпри 37 С в течение 16 часов. Разделение ПЦР-ПДРФ фрагментов проводили в 6 -ном полиакриламидном геле в 1 буфере, окрашивали в растворе этидиум бромида, затем полученную электрофореграмму фотографировали цифровой камерой 2100 в УФ-свете. Пример выполнения способа. Предложенный способ был применен для видовой идентификации образцов крови и перьев подорликов, собранных у гнезд в течение гнездового сезона 2007 г. в Беларуси 7. Первоначально, для проверки разработанного маркера, выборочно мы проанализировали образцы, взятые нами для анализа в 2006 году и типированные с помощью ПЦР-ПДРФ анализа гипервариабельного района Д-петли. Результаты анализа по двум районам мт ДНК совпали, дальнейшую работу мы проводили на новых образцах 2007 года. Полученные результаты показали, что предложенные способы дополняют друг друга и позволяют проводить более корректную видовую дифференциацию большого подорликаи малого подорлика. Источники информации 1.... - ,, 1996. - . 1-15. 2. Домбровский В.Ч. // Орнитология. - 2007. - Т.33. - С. 29-41. 3.. // . - 2004. - . 145. - Р. 256-263. 4. //. - 2002. - . 11. - . 2189-2194. 5.. //. - 2005. - . 35. - . 147-164. 6. Заявка на патент РФ 2006119781/13. Способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока. 2006.06.06. 7. Аксенова Е.А. и др. Изучение и охрана большого и малого подорликов в Северной Евразии Материалымеждународной конференции по хищным птицам Северной Евразии. - Иваново, 2008. - С. 18-25. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3