Способ получения фитофтороустойчивого картофеля

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОФТОРОУСТОЙЧИВОГО КАРТОФЕЛЯ(71) Заявитель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству(72) Авторы Яковлева Галина Анатольевна Семанюк Тамара Владимировна(73) Патентообладатель Республиканское унитарное предприятие Научнопрактический центр Национальной академии наук Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству(56)1604276 1, 1990. Семанюк Т.В. и др. Генетика и селекция на рубежевека. Сборник работ молодых ученых. - Минск, 1999. С. 67-69. Яковлева Г.А. и др. Картофелеводство // Научные труды. Вып. 9. Минск, 1997. С. 64-81.., 1987. - . 74. -3. . 364-368. Пискун Г.И. и др. Актуальные проблемы современного картофелеводства. Материалы Международной научной конференции. Минск, 1997. - С. 35-36.(57) Способ получения фитофтороустойчивого картофеля путем прямого слияния протопластов дикого и культурного картофеля в качестве донора и реципиента цитоплазмы,включающий выделение протопластов донора и реципиента с использованием одинаковой ферментной смеси, отмывку протопластов в одинаковой среде, слияние протопластов в щелочном буфере, содержащем 2 и 30 полиэтиленгликоля, культивирование продуктов слияния протопластов в питательной среде 55 на рассеянном свету до образования визуально обнаруживаемых индивидуальных колоний, использование агаризованной среды СТ 1 для инкубирования колоний до образования гибридных фотосинтезирующих колоний, индукцию морфогенеза путем высаживания фотосинтезирующих колоний на агаризованную среду СТ 2, укоренение и размножение растений-регенерантов на среде Мурасиге-Скуга и идентификацию гибридов, отличающийся тем, что в качестве донора цитоплазмы используют дикий видс полноценными ядром и цитоплазмой, устойчивый к фитофторозу ботвы и клубней, а в качестве реципиента культурный картофель, который является цитоплазматическим хлорофиллдефектным мутантом, при этом протопласты выделяют с использованием ферментной смеси, содержащей 0,510 и 0,510, которую предварительно центрифугируют, образовавшиеся визуально обнаруживаемые индивидуальные колонии переносят на поверхность агаризованной среды СТ 1, индукцию морфогенеза проводят при температуре 18-20 С, а для укоренения побегов используют среду МурасигеСкуга, содержащую 10 г/л сахарозы, 1 мг/л витамина В 1, 0,5 мг/л витамина В 6, 0,25 мг/л эпибрассенолида, 0,5 мг/л гиббереллина А 3, 0,5 мг/л аденина и 0,2 мг/л 3-индолилмасляной кислоты. 9691 1 2007.08.30 Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу создания картофеля, устойчивого к фитофторозу и ботвы и клубней одновременно за счет перенесения в геном культурного картофеля факторов генетического контроля устойчивости к фитофторозу от дикого мексиканского вида, выработавшего генетически детерминированную устойчивость к болезни вследствие длительной совместной эволюции возбудителя фитофторозаи вида .в одной и той же географической зоне. Дикий мексиканский вид .не скрещивается с селекционными сортами и с большинством видов . Таким образом, непосредственная интрогрессия генов контроля фитофтороустойчивости от .в культурные сорта с помощью традиционных скрещиваний невозможна. Изобретение основано на использовании метода клеточной инженерии - соматической гибридизации, позволяющей слить протопласты двух несовместимых видов в одну ступень с последующей регенерацией из продукта слияния целого растения, содержащего гены и ядра и цитоплазмы от обоих родителей и таким образом относится также к области биотехнологии. Известен способ получения фитофтороустойчивого картофеля путем интрогрессии генов .в культурный картофель методом посредника 1. К недостаткам способа относится интрогрессия в геном культурного картофеля только генов ядра без использования цитоплазмона и наличие у полученной формы отрицательных признаков, свойственных дикому виду невысокая урожайность, недостаточный вес клубней, длинные столоны и др. Известен способ получения фитофтороустойчивого картофеля путем интрогрессии генов .в культурный картофель за счет предварительной перед скрещиванием с селекционным образцом полиплоидизации дикого вида 2, 3. Недостатками способа является то, что у полученного фитофтороустойчивого картофеля был низкий урожай, мелкие клубни, длинные столоны, неспособность к дальнейшей гибридизации. Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа, является способ получения растений с чужеродной цитоплазмой 4, предусматривающий получение растений с комплексом полезных признаков, к которым у картофеля в том числе относится устойчивость к фитофторозу, путем слияния протопластов донора и реципиента чужеродной цитоплазмы, использования в качестве донора цитоплазмы растения картофеля, а в качестве реципиента цитоплазмы растения хлорофиллдефектного мутанта картофеля, путем выделения протопластов в одинаковой ферментной смеси, слияния протопластов в одинаковом растворе при одинаковых условиях, использование для отмывки протопластов одинаковой среды, использование для слияния протопластов методики Менцеля с использованием 30 полиэтиленгликоля (ПЭГ) и буфера с 2 и щелочным рН, культивирование продуктов слияния протопластов на рассеянном свету до образования визуально обнаруживаемых индивидуальных колоний, культивирование колоний на средеСТ 1 5 до образования гибридных колоний зеленого цвета, проведение индукции морфогенеза из гибридных колоний на среде СТ 2 5, предварительную индентификацию гибридов проводят по способности продуктов слияния восстанавливать фотосинтез 4. Недостатком этого способа является то, что донором чужеродной цитоплазмы был высокоасимметричный гибрид, имеющий чужеродную цитоплазму, созданный на ядерной основе хлорофиллдефектного мутанта и который дополнительно облучался -лучами дозой 25 крад (250 Гр), что уменьшило количество чужеродных цитоплазматических и ядерных генов, а также обеднило число возможных ядерно-цитоплазматических взаимодействий. Кроме того, использование в соматической гибридизации одновременно двух партнеров с генетическими нарушениями протопласты хлорофиллдефектного мутанта и облученные протопласты высокоасимметричного гибрида на ядерной основе хлорофиллдефектного мутанта вряд ли может сопровождаться дифференциальным развитием после их слияния в генетически полноценный организм. 2 9691 1 2007.08.30 Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способа создания фитофтороустойчивого картофеля за счет интрогрессии в его геном факторов генетического контроля устойчивости к фитофторозу и ботвы и клубней от дикого мексиканского вида. , нескрещиваемого с культурным картофелем. Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе получения фитофтороустойчивого картофеля путем прямого слияния протопластов дикого и культурного картофеля в качестве донора и реципиента цитоплазмы, включающий выделение протопластов донора и реципиента с использованием одинаковой ферментной смеси, отмывку протопластов в одинаковой среде, слияние протопластов в щелочном буфере, содержащем 2 и 30 полиэтиленгликоля, культивирование продуктов слияния протопластов в питательной среде 55 на рассеянном свету до образования визуально обнаруживаемых индивидуальных колоний, использование агаризованной среды СТ 1 для инкубирования колоний до образования гибридных фотосинтезирующих колоний, индукцию морфогенеза путем высаживания фотосинтезирующих колоний на агаризованную среду СТ 2, укоренение и размножение растений-регенерантов на среде Мурасиге-Скуга и идентификацию гибридов, - а в качестве донора цитоплазмы используют дикий видс полноценными ядром и цитоплазмой, устойчивый к фитофторозу ботвы и клубней, а в качестве реципиента культурный картофель, который является цитоплазматическим хлорофиллдефектным мутантом, при этом протопласты выделяют с использованием ферментной смеси, содержащей 0,510 и 0,510,которую предварительно центрифугируют, образовавшиеся визуально обнаруживаемые индивидуальные колонии переносят на поверхность агаризованной среды СТ 1, индукцию морфогенеза проводят при температуре 18-20 С, а для укоренения побегов используют среду Мурасиге-Скуга, содержащую 10 г/л сахарозы, 1 мг/л витамина В 1, 0,5 мг/л витамина В 6, 0,25 мг/л эпибрассенолида, 0,5 мг/л гиббереллина 3, 0,5 мг/л аденина и 0,2 мг/л 3-индолилмасляной кислоты. Пример конкретного выполнения. Источниками протопластов служат культивируемыеследующие растения реципиент - растения хлорофиллдефектного мутанта селекционного образца картофеля 78563-76, донор - растения образца вида . , предварительно отобранного по устойчивости к фитофторозу и ботвы и клубней. Листья 5-6 недельных растений нарезают узкими полосками шириной 1-2 мм и помещают на поверхность ферментного раствора объемом 8-10 мл в конические колбы на 100 мл. Ферментную смесь, содержащую 0,5-10 , 0,5-10 , 0,5 сахарозу и 5 мМ СаС 122 Н 2 О (рН 5,7), перед стерилизацией фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм центрифугируют 15 мин при 2000 об/мин, что позволяет удалить из смеси агрегаты молекул ферментов и возможные примеси, способные вызвать функциональное нарушение мембраны протопластов - плазмалеммы, и таким образом увеличить число жизнеспособных протопластов. Нарезанные листья инкубируют в темноте в течение 14-16 часов в термостате при температуре 28 С. Затем ферментную смесь с суспензией протопластов фильтруют через капроновое сито с диаметром пор 60-100 мкм в пробирку объемом 10-15 мл для удаления эпидермиса и жилок листьев и центрифугируют 4 мин при 1000 об/мин. Флотируемые протопласты собирают пипеткой и переносят в чистую пробирку. К суспензии протопластов, объемом 0,5-1 мл добавляют при перемешивании 810 мл среды 5, содержащей- 9 г/л СаС 22 Н 2 О - 13,9 г/л, С - 0,9 г/л, глюкоза 1 г/л (рН 5,7). После этого суспензию центрифугируют 4 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Протопласты исходных форм смешивают в отношении 11 и добавляют среду 5. Смесь суспензий протопластов центрифугируют в течение 4 мин при 1000 об/мин. После этого надосадочную жидкость удаляют. Смесь протопластов, объемом около 0,1 мл, помещают в чашку Петри (4010 мм). Ее выдерживают в течение 15-20 мин для осаждения протопластов. Затем к смеси протопластов добавляют каплю раствора 3 9691 1 2007.08.30 ПЭГ, содержащего 30 ПЭГ (м.в. 4000) 0,3 М глюкозу 66 мМ СаС 22 Н 2 О. Раствор ПЭГ стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Через 15 мин пипеткой удаляют надосадочную жидкость, содержащую раствор ПЭГ. Сразу же к смеси протопластов добавляют около 0,1 мл раствора для отмывки ПЭГ, состоящего из смеси растворов А и Б. Раствор А 0,4 М глюкозы, 66 мМ СаС 22 Н 2 О и 10 диметилсульфоксида. Раствор Б 0,3 М глицин (рН-10,5). Растворы А и Б готовят заранее и хранят в морозильной камере при -18 С. Растворы А и Б размораживают и смешивают в соотношении 91 непосредственно перед применением, затем стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Через 20 мин к смеси протопластов медленно добавляют питательную средуили 55, стерилизованную фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Еще через 20 мин средуили 55 в чашке Петри заменяют на свежую и чашку заклеивают парафилмом. Чашку Петри с суспензией протопластов ставят на рассеянный свет (400 Лк) при температуре 20-22 С. Каждые 8-10 дней к находящейся в чашках Петри суспензии клеток добавляют свежую питательную средуили 55. По мере разбавления часть клеток со средой переносят в другие чашки. После образования из продуктов слияния протопластов визуально обнаруживаемых индивидуальных микроколоний их захватывают пипеткой и вместе со средойили 55 переносят на поверхность агаризованной среды СТ 1, содержащей агарозу 0,6-1 , и дополнительно добавляют 2-3 мл свежей средыили 55. Упрощение процедуры пролиферации визуально обнаруживаемых микроколоний по сравнению с прототипом достигается тем, что их переносят непосредственно на поверхность твердой среды СТ 1. В прототипе стадии переноса микроколоний на твердую среду СТ 1 предшествуют стадии предварительного их заплавления в среду СТ 1 и последующего через 10-15 дней извлечения из агара. Кроме того, заплавление визуально обнаруживаемых индивидуальных колоний из только что приступивших к делению клеток увеличивает риск повреждения микроколоний повышенной температурой. Микроколонии инкубируют на свету (2000 Лк) при температуре 20-22 С для их пролиферации вплоть до образования фотосинтезирующих колоний из плотного каллуса диаметром 1-3 мм. Для индукции морфогенеза макроколонии высаживают на агаризованную среду СТ 2 и культивируют с периодическими пассажами на свежую среду СТ 2 при температуре 18-20 С с 16-ти часовым фотопериодом вплоть до регенерации растений. Предлагаемое в прототипе культивирование при 24 С с 16-ти часовым фотопериодом в течение 25-30 дней не сопровождается регенерацией растений ни в продуктах слияния протопластов селекционного образца и образца . ,ни отдельно культивируемых протопластов .на среде СТ 2. Растениярегенеранты в виде розетки листьев нам удалось получить только в продуктах слияния протопластов через 25 недель культивирования при 18-20 С с 16-ти часовым фотопериодом. Способность к регенерации фотосинтезирующих растений использована для предварительного отбора растений, несущих гены и селекционного образца 78563-76 (регенерация желтых растений, не способных к самостоятельному фотосинтезу), и гены .(дифференциальное развитие клеток останавливается на стадии образования зеленых макроколоний без регенерации растений). Растения-регенеранты в виде розетки листьев с кусочком каллуса переносят на жидкую среду для укоренения, содержащую минеральные элементы по МС, сахарозу - 10 г/л, витамины В 1 - 1 мг/л и В 6 - 0,5 мг/л, эпибрассенолид 0,25 мг/л, гиббериллин 3 - 0,5 мг/л, аденин - 0,5 мг/л, ИМК - 0,2 мг/л. Использование данной среды позволяет получить растения нормального фенотипа стебель с междоузлиями и листьями с развитой корневой системой. На среде МС, использованной для укоренения побегов в прототипе, растения, регенерированные из продуктов слияния протопластов хлорофиллдефектного мутанта селекционного образца 78563-76 и образца . ,сохраняют вид розеток листьев без выраженных стеблей и без корней, которые постепенно темнеют и погибают. Растения нормального фенотипа размножают и используют для идентификации гибридов электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и оценки на 4 9691 1 2007.08.30 устойчивость к фитофторозу ботвы и клубней. Все растения, регенерированные в данной комбинации изложенным способом, содержали видоспецифичные белковые полосы обоих родителей и были устойчивы к фитофторозу. Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет на основе специально отобранного образца вида . , устойчивого к фитофторозу и ботвы, и клубней, и без использования облучения, которое разрушает кариотип . , получить картофель, обладающий устойчивостью к фитофторозу и ботвы и клубней, с короткими столонами, формирующий товарные клубни, завязывающий ягоды с полноценными семенами и передающий признак устойчивости к болезни своему половому потомству. Подобный результат достигается в одну ступень непосредственно в продуктах слияния протопластов дикого вида и культурного картофеля и не требует в отличие от известного способа получения фитофтроустойчивого картофеля за счет интрогрессии генов .предварительного скрещивания с видом посредником 1 или в отличие от другого известного способа 2, 3 полиплоидизации дикого вида перед скрещиванием с культурным картофелем. Источники информации 1. Подгаецкий А.А. Межвидовая несовместимость картофеля. Методы и способы ее преодоления (Методические рекомендации). - Киев Институт картофелеводства, 1993. С. 19, 29-34, С. 73. 2. Житлова Н.А. Вовлечение в гибридизацию дикого вида картофеля // Картофель и овощи. - 1972. -7. - С. 21. 3. Житлова Н.А. Полиплоиды в селекции картофеля // Труды по прикладной ботанике,генетике и селекции. - 1982. - Т. 73, Вып. 2. - С. 66-72. 4. А.с. 1604276 СССР, МПК А 01 Н 4/00. Опубл. 07.11.90 // Бюл.41 (прототип). 5. А.с. 1604275 СССР, МПК А 01 Н 4/00. Опубл. 07.11.90 // Бюл.41. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5