{[(22R,23R,24S)-2?,3?,22,23-Тетрагидрокси-24-этил-5?-холест-6-илиденамино]окси}уксусная кислота в качестве гаптена в синтезе конъюгата 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Хрипач Владимир Александрович Литвиновская Раиса Павловна Райман Михаил Эдуардович Драч Светлана Васильевна Жабинский Владимир Николаевич Свиридов Олег Васильевич Прядко Андрей Георгиевич Новик Татьяна Валентиновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси в качестве гаптена для получения иммуногена - конъюгата 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином. Изобретение относится к области органической химии, а именно новому химическому соединению - (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5-холест-6-илиденаминооксиуксусная кислота (далее гаптен 28-гомокастастерона) структурной формулы Заявляемое соединение может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 28-гомобрассиностероидам. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений 1, 2. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях менее 10-5 . В очень малых концентрациях они проявляют свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням 3-8. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее активных брассиностероидов является 28-гомобрассинолид, на основе которого разработан препарат ЭПИН-плюс 9. В связи с этим актуальной является разработка методов анализа 28-гомобрассинолида, а также его химического и биохимического предшественника 28-гомокастастерона (далее 28-гомобрассиностероиды). В качестве такого метода нами предложен метод иммуноферментного определения 28 гомобрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые, в свою очередь, могут быть получены через соответствующие гаптены. В настоящее время известен гаптен на основе кастастерона - соединение формулы который предложен авторами для получения конъюгата с белком - бычьим сывороточным альбумином (БСА) для выработки антител, использованных в радиоиммуноанализе брассиностероидов 10. Однако синтезированный таким образом конъюгат не позволил получить антитела, специфичные к группе 24-метилбрассиностероидов, для анализа которых 2 11831 1 2009.04.30 он был предназначен - показатели перекрестных реакций с другими брассиностероидами составляли от 20 до 50 . Известен также гаптен брассинолида формулы который представляет собой эфир янтарной кислоты по С 3-гидроксильной группе брассинолида 11. Синтезированный на его основе конъюгат с мышиным альбумином также не позволил получить антитела, специфичные к исходным 24-метилбрассиностероидам. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает конъюгат на его основе нестабильным. Для анализа 24-метилбрассиностероидов получены антитела на основе конъюгата 24 эпикастастерона с БСА, синтез которого осуществляли с использованием гаптена формулы 12, 13 Однако полученные таким образом антитела не позволяют определять 28 гомобрассиностероиды (28-гомобрассинолид и 28-гомокастастерон) с высокой степенью чувствительности и специфичности. Гаптены на основе 28-гомобрассиностероидов неизвестны. Задачей настоящего изобретения является (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5-холест-6-илиденаминооксиуксусная кислота в качестве гаптена (полупродукта) в синтезе иммуногена - конъюгата 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином. Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который получают взаимодействием 28-гомокастастерона с гидрохлоридом О-карбоксиметилгидроксиламина в водном пиридине, выделением и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле. Пример 1. 11831 1 2009.04.30 К раствору 0,11 г (0,2 ммоль) 28-гомокастастерона в 3 мл пиридина добавляют раствор 0,085 г (0,67 ммоль) гидрохлорида карбоксиметиламина в 1 мл воды. Реакционную смесь кипятят 6 часов, затем выливают в воду, экстрагируют хлороформом, экстракт упаривают. Хроматографируют на силикагеле. Получают 0,115 мг продукта (1) (96 ). Т.пл. 139141 С (хлороформ/метанол). ИК спектр (К), (см-1) 1710 (СО), 2500-3000 (ОН), 3600(3) 12,39, 12,59, 13,29, 14,23, 20,14, 20,17, 21,64, 22,33, 24,94, 28,78, 29,26, 30,39,31,67, 36,84, 38,65, 40,76, 41,10, 41,44, 43,87, 44,62, 48,23, 53,90, 55,64, 57,90, 69,42, 69,84,70,76, 73,67, 75,59, 162,85, 174,28. Синтезированный гаптен используют для получения конъюгата 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином (БСА), что подтверждается приведенным ниже примером 2. Пример 2. Конъюгат 28-гомокастастерона (1) с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Растворяют 0,031 г (0,056 ммоль) оксима (1) и 0,008 г (0,07 ммоль) оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана. Охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 0,012 мг дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Осадок растворяют в этилацетате, дополнительно образовавшийся осадок дициклогексилкарбомочевины отфильтровывают, фильтрат упаривают. Получают 0,035 мг (94 ) 6-оксисукцинимидного эфира (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5 холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты. Маслообразное вещество. ИК спектр(пленка), (см-1) 1730 (СО), 1770 (СО), 3400 (ОН). Спектр ЯМР 1 Н , м.д. (3) 0,67 с (3 Н, 18-Ме), 0,75 с (3 Н, 19-Ме), 0,90 д (3 Н,6,6 Гц, 26 ), 0,94 д (3 Н,6,7 Гц, 29-Ме),0,95 д (3 Н,6 Гц, 21-), 0,97 д (3 Н,6,6 Гц, 27-Ме), 2,68 дд (1 Н, 1 2,5 Гц, 2 12,5 Гц, С 5 Н), 2,73 м (4 Н), 3,58 д (1,8,4 Гц, С 22 - Н), 3,72 м (2 Н, С 2 - и С 23 - Н), 3,95 м (1, С 3 Н), 4,52 м (2 Н, -О-СН 2-СООН). К раствору 52 мг (0,75 мкмоль) БСА в смеси 9 мл воды и 1 мл насыщенного раствора 3 (8,3) добавляют раствор 35 мг (55 мкмоль) 6-оксисукцинимидного эфира(22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5-холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты в 10 мл диоксана. Раствор перемешивают 20 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергают диализу при 20 С против дист. воды в течение 36 ч, затем 20 ч - против 1 -ной суспензии активированного угля в воде, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 С. Полученный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 28 гомобрассиностероидам (28-гомобрассинолид и 28-гомокастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 3. Получение антител. Группу из шести кроликов иммунизируют конъюгатом 28-кастастерон-БСА с плотностью посадки 23 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного 0,1 М раствора поваренной соли ( 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 2 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на на 4 11831 1 2009.04.30 личие связывающей способности в отношении кастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки,обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5 - 0,2 ОЕ. Таблица 1 Характеристики антисыворотки, полученной при иммунизации животных конъюгатом 28-гомокастастерона с БСА. Ка 109 М-1 4,5 Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,что ее разбавление в 50 000 (А 1) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как 28-гомокастастерона, так и 28-гомобрассинолида, проявивших, как и ожидалось,сравнимые параметры связывания с антителами. Специфичность. Перекрестная реакция антител, полученных к 28-гомокастастерону, с другими брассиностероидами и стероидами различных классов приведена в табл. 2. Таблица 2 Кросс-реактивность антисыворотки А 1 с различными стероидами Связывание по отношению к 28 Структурная формула Название п/п гомокастастерону,Продолжение таблицы 2 Связывание по отношению к 28 гомокастастерону,Продолжение таблицы 2 Связывание по отношению к 28 гомокастастерону,Продолжение таблицы 2 Связывание по отношению к 28 гомокастастерону,Таким образом, полученные антитела обладают специфичностью (определяется только 28-гомокастастерон и 28-гомобрассинолид) и чувствительностью, достаточной для обнаружения кастастерона и брассинолида в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 5-7 пг 28 гомобрассиностероида в 50 мкл образца. Источники информации 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Мн. Навукатэхнка, 1993. - 288 с. 2.,,.. -. , 1999. - 456 . 3. Патент РБ 2806, 2000. 4. Патент РБ 3488, 2000. 5. Патент РБ 3400, 2000. 6. Патент РБ 5168, 2003. 7. Патент РБ 5212, 2003. 8. Патент РБ 5698, 2003. 9. ТУ РБ 100185129.048 - 2002. Брассиностероиды и препаративные композиции на их основе. - Введ. 2003-02-05. Технические условия. Каталог. - Мн. Из-во Госстандарт РБ,2007. Т.2. - С.549. 10.Т.,.,.,.,.//. - 1990. - . 9. - .151. 11..,//. (.). - 1988. - . 86. . 113. 12. Патент РБ 10120, 2007. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9