Новая рекомбинантная форма ВИЧ-1/Mos: BA (BgagApolAenv) для изучения генома и эволюции вируса ВИЧ-1 или скорости его изменчивости

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ РЕКОМБИНАНТНАЯ ФОРМА ВИЧ-1/ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНОМА И ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА ВИЧ-1 ИЛИ СКОРОСТИ ЕГО ИЗМЕНЧИВОСТИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Еремин Владимир Федорович Гасич Елена Леонидовна Сосинович Святослав Викторович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(56) МАШАРСКИЙ А.Э. Изучение генетического разнообразия и анализ генома ВИЧ-1 в странах бывшего СССР Автореф. дис. - Санкт-Петербург, 2005. С. 4-14. СУХАНОВА А.Л. и др. Вопросы вирусологии. - 2004. - Т. 49. -6. - С.4-9... . - 1998. - . 12. - . 14. - Р.1907-1919..// по генам ,ипод номерами соответственно 775442.1,995656.1 и 775443.1, предназначенная для изучения генома и эволюции вируса ВИЧ-1 или скорости его изменчивости. Изобретение относится к вирусологии и молекулярной биологии, а именно к выделению нового варианта рекомбинантной формы вируса иммунодефицита человека 1 типа(ВИЧ-1)для научных целей - изучения генома вируса, эволюции ВИЧ-1,скорости его изменчивости. В настоящее время выделяют два типа ВИЧ ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Пандемия ВИЧинфекции связана с ВИЧ-1. ВИЧ-2, в основном, выявляется в Западной Африке, хотя отдельные случаи ВИЧ-инфекции, связанные с ВИЧ-2, были описаны в Восточной Африке,Европе (в том числе и в Белоруссии), Азии, Северной и Южной Америке 1-6. Филогенетический анализ штаммов ВИЧ-1, изолированных в разных географических регионах, показал, что все эти вирусы могут быть выделены в группы, субтипы и циркулирующие рекомбинантные формы 7, 8, 9, 10. Выделяют три группы или линии ВИЧ-1,(-,или ) и. Большинство изолятов ВИЧ-1,18124 1 2014.04.30 ответственных за пандемию ВИЧ-инфекции, относятся к группе . Вирусы группыэндемичны и выявляются, в основном, в Камеруне и соседних странах Западной и Центральной Африки 11,12, 13. Группаобъединяет вирусы, изолированные в Камеруне 14, 15. Внутри группывсе вирусы филогенетически делят на субтипы. В настоящее время выделяют девять субтипов, обозначенных латинскими буквами -, -,и . Вирусы группыне делятся на субтипы, поскольку при филогенетическом анализе не выявляется такое же разнообразие геномов ВИЧ, как в группе . В настоящее время используются четыре типа категорий для обозначения главной линии ВИЧ-1 группы, субтипы, суб-субтипы и. Группы обозначают характерные линии ВИЧ-1 ,и . Группавключает вирусы,которые доминируют в глобальной эпидемии. Группы были обозначеныдля основных, для ,для не- не 15. Субтипы обозначают главные клайды внутри группы . Суб-субтипы обозначают разные линии, которые очень близко родственны к отдельным линиям субтипов, но не являются достаточно генетически отдаленными для присвоения им нового субтипа. Ранее определенный субтипможет быть таким образом переименован в суб-субтип 1 и гипотетически в заново определенную линию, названную суб-субтип 2. Циркулирующие рекомбинантные формыпредставляют собой рекомбинантные линии, которые играют важную роль в пандемии ВИЧ-1. Членыдолжны иметь идентичную мозаичную структуру, то есть они произошли в результате одинаковых рекомбинантных событий. Как оказалось, все субтипы ВИЧ-1 ассоциированы с различными территориями и континентами. Субтиптипичен для Северной и Южной Америки, Западной Европы, Африки, стран юго-восточной Азии, Австралии, Японии ,и Д - для Африки ( описан еще в Индии)- для Таиландаописан в Румынии и Бразилии- в Центральной Африке, на Тайване, Заире и г. Элисте (Россия)- в центральной Африке, Заире и Восточной Европе- на Кипре Ближнем Востоке- в центральной Африке 16, 17, 18, 19, 20, 21. Известна рекомбинантная форма ВИЧ-1 03, 193276.1-1 03 153 и 414006.19810443 , описанная в Калининграде и Беларуси соответственно. Однако оба этих вируса имеют следующую структуру генома , , . Задачей изобретения является описание нового отечественного варианта рекомбинантной формы ВИЧ-1 для изучения генома и эволюции вируса ВИЧ-1 или скорости его изменчивости. Результат достигается путем секвенирования и анализа последовательностей генома новой рекомбинантной формы вируса иммунодефицита человека типа////300068202. Получение последовательностей новой рекомбинантной формы ВИЧ-1 изолят . РНК вируса была изолирована из плазмы крови ВИЧ-инфицированного ребенкадевочки ., 2004 г.р., г. Минск. В настоящее время клинически находится в стадии 1 на момент забора крови для выделения вируса. Клинический материал получен из Минской городской детской инфекционной клинической больницы, изоляция РНК вируса проведена в лаборатории диагностики ВИЧ и сопутствующих инфекций, отдела клинической вирусологии в ГУ РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь. Новая рекомбинантная форма ВИЧ-1 по генам ,идепонирована в Международную базу данных // под номерами 775442.1 (21.01.2011) ////775442., 995656.1 (от 02.07.2010) ////300068202, 775443.1 (21.01.2011) ////775443.1. 2 18124 1 2014.04.30 При получении данной рекомбинантной формы использованы методы молекулярной биологии выделение вируса высокоскоростным центрифугированием, выделение РНК,проведение реакции обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции,проведение секвенирующей ПЦР по фрагментам структурных генов, проведение электрофоретического разделения полученных фрагментов на генетическом анализаторе 3100 , анализ полученных после электрофоретического разделения фрагментов с использованием компьютерных программ, филогенетический анализ фрагментов ДНК по структурным генамс использованием компьютерной программы 4. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ, . и . Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов были выровнены, в них были найдены рамки считывания и получены соответствующие аминокислотные последовательности. Для филогенетического анализа полученные нуклеотидные последовательности были выровнены с нуклеотидными последовательностями референсных изолятов ВИЧ-1, взятых из базы данных полных нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов ВИЧ-1 с помощью программы. Филогенетический анализ проводили с использованием пакета программ . Для анализа геномов ВИЧ 1 на наличие рекомбинации применяли программу . Свойства новой рекомбинантной формы ВИЧ-1. Средние р-дистанции (определяющие степень гомологии между вирусами), определенные нами с помощью компьютерной программы 4.1, между изолятом ВИЧ-1/ и референс последовательностями субтипаВИЧ-1 из России, Украины составили 0,068, а с референс последовательностями субтипа- 0,094. Ближе всего изолят ВИЧ-1/ располагался к украинскому изоляту 413987 субтипа , р-дистанции составили 0,066. При сравнении последовательностей по генуизолята ВИЧ-1/ с референс последовательностями рекомбинантной формы 03 из Беларуси и Калининграда(414006.1,и 193276.1 03 153) было показано, что средние рдистанции составляют 0,090, в то время как средние р-дистанции между референс штаммами составили 0,009. Таким образом было показано, что по генуизолята ВИЧ-1/ относится к субтипуВИЧ-1. При сравнении последовательностей ДНК изолята ВИЧ-1/ по фрагменту генаучастка р 17/р 24 с референс последовательностями ВИЧ-1 субтипабыло определено, что средние р-дистанции составили 0,129, а с референс последовательностями субтипа 0,075. Средние р-дистанции между последовательностями генаизолята ВИЧ-1/ с последовательностями рекомбинантной формы 03 ВИЧ-1 (414006.1,и 193276.1 03 153) составили 0,121 в сравнении с 0,013 при сравнении рекомбинантных вирусов между собой. Таким образом, по генувирус был отнесен к субтипу . При анализе изолята ВИЧ-1/ по генусредние р-дистанции с референс последовательностями субтипасоставили 0,323, а с субтипом- 0,155. Средние рдистанции по генуизолята ВИЧ-1/ и рекомбинантного вируса 03 414006.1 и 193276.1 составили 0,308. Таким образом по генувирус был отнесен к субтипуВИЧ-1. Таким образом, полученный нами изолят ВИЧ-1/ является рекомбинантной формой ВИЧ-1 и имеет следующую структуру- в отличие от известной рекомбинантной формы 03, имеющей структуру . Результаты проведенных исследований показали, что при филогенетическом анализе по участку генаизолят ВИЧ-1/ кластрировался вместе с ВИЧ-1 субтипа , но отдельно от других анализируемых образцов субтипаи референс штамма субтипа 18124 1 2014.04.30 Приведенные примеры раскрывают сущность изобретения. Пример 1. Секвенирование изолята ВИЧ-1/ по гену(р 17/р 24), представлены на фиг. 1 Пример 2. Секвенирование изолята ВИЧ-1/ по гену , представлены на фиг. 2. Пример 3. Секвенирование изолята ВИЧ-1/ по гену(3 петля 120), представлены на фиг. 3. На фиг. 4 представлен филогенетический анализ фрагмента ДНК изолята ВИЧ-1/ по участку гена . На фиг. 5 представлен филогенетический анализ фрагмента ДНК изолята ВИЧ-1/ по участку гена . На фиг. 6. представлен филогенетический анализ фрагмента ДНК изолята ВИЧ-1 / по участку гена . Источники информации 1..,., - .,./// . - 1986. - . 233. - . 343-346. 2..,.,.,. /-, --//. 1987. - . 3. - . 3-10. 3..,.,.,.2//. 1994. - . 68. - . 7433-7447. 4..,.,.,./-2- // . - 1989. - . 342. - . 948-950. 5.,,,. 20-2//. - 2009. - . 15. - . 1166-1167. 6..,.,,.-1-2//. - 2005. - . 81. . 338-41. 7.,,//. 1995. - . 40. - . 249-259 8.,,,,.,,., ,,.,,.,.,.,.,.,.,,.,. -1// . - 2000. - . 288. - . 55-56. 9.,,,,.,, .,,,.,,.,.,., .,.,.,,.,. -1//. - 1999.,.,.,.,., ,,,.. .,,, . 10..,,,.,.,.,.//. -1994. - . 68. - . 1586-1596. 11.., - .,.,.,.,.,, -., - .,.4 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7