Фрагмент ДНК, полученный путем молекулярного клонирования из Streptomyces griseus ATCC 10137, кодирующий SAF-полипептид, SAF-полипептид, рекомбинантная плазмидная ДНК, определяющая экспрессию SAF-полипептида (варианты), рекомбинантная плазмидная ДНК pULA

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ФРАГМЕНТ ДНК, ПОЛУЧЕННЫЙ ПУТЕМ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ ИЗ 10137,КОДИРУЮЩИЙ -ПОЛИПЕПТИД, -ПОЛИПЕПТИД,РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ -ПОЛИПЕПТИДА (ВАРИАНТЫ),РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК 3, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК 300, ШТАММ ГРИБА, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАТНУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК 3, И СПОСОБ ЭКСПРЕСИИ -ПОЛИПЕПТИДА(71) Заявитель Апплайд Резеч Системз АРС Холдинг Н. В.(72) Авторы Антонио Даса Ортега, Хосе Антонио Хиль, Томас Вигаль Гарсиа, Хуан Франсиско Мартин(73) Патентообладатель Апплайд Резеч Системз АРС Холдинг Н. В.(57) 1. Фрагмент ДНК, полученный путем молекулярного клонирования изАТСС 10137,кодирующий -полипептид и имеющий последовательность нуклеотидовТССАССТССССС САССТСССАСССС. Фиг. 1 2. -полипептид мол. м. около 15000 Да, кодируемый фрагментом ДНК, охарактеризованным в п. 1,обладающий способностью активировать образование вторичных метаболитов стрептомицетов и имеющий 3186 1 последовательность аминокислот, установленную на основании последовательности нуклеотидов фрагмента ДНК, охарактеризованного в п. 1. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК, определяющая экспрессию -полипептида, содержащая следующие конструктивные элементы последовательность ДНК из, включающую фрагмент ДНК, охарактеризованный в п. 1, и при необходимости промотор генаструктуры фрагмент ДНК плазмиды 702, включающий ген резистентности к тиострептону и ген Ме 1, кодирующий тирозиназу. 4. Рекомбинантная плазмидная ДНК 3, определяющая экспрессию -полипептида, содержащая следующие конструктивные элементы последовательность ДНК изАТСС 10137 размеромт.п.н., включающую фрагмент ДНК, охарактеризованный в п. 1, и промотор генаструктуры фрагмент ДНК плазмиды 702, включающий ген резистентности к тиострептону и ген Ме 1, кодирующий тирозиназу. 5. Рекомбинантная плазмидная ДНК, определяющая экспрессию -полипептида, содержащая следующие конструктивные элементы последовательность ДНК из, включающую фрагмент ДНК, охарактеризованный в п. 1, и при необходимости промотор генаструктуры фрагмент ДНК плазмиды 699, включающий ген резистентности к тиострептону, биомицину и канамицину. 6. Рекомбинантная плазмидная ДНК 300, определяющая экспрессию -полипептида, содержащая следующие конструктивные элементы последовательность ДНК изразмером 1 т.п.н., включающую фрагмент ДНК, охарактеризованный в п. 1, и промотор генаструктуры фрагмент ДНК плазмиды 19, включающий промотор гена. 7. Штамм гриба, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК 3,охарактеризованную в п. 4. 8. Способ экспрессии -полипептида, заключающийся в том, что клетки микроорганизма трансформируют фрагментом ДНК, охарактеризованным в п. 1, культивируют трансформированные клетки в подходящей питательной среде и выявляют экспрессию -полипептида.(56) Аналогов в патентной и научно-технической литературе не обнаружено. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому полипептиду, усиливающему продукцию внеклеточных энзимов, фрагменту ДНК, который кодирует этот полипептид, рекомбинантной плазмидной 3186 1 ДНК, которая содержит данный фрагмент ДНК, и штамму, трансформированному рекомбинантной плазмидной ДНК. Кроме того, изобретение относится к последовательности промотора гена, кодирующего новый полипептид, экспрессионной системе на основеи способу экспрессии чужеродных последовательностей ДНК в , кодирующих секретируемые полипептиды и белки. Видыявляются хорошо известными продуцентами разнообразных внеклеточных ферментов, включая протеазы, фосфатазы, ксиланазы, целлюлазы, амилазы, липазы и нуклеазы. Однако регуляторные механизмы, которые управляют экспрессией этих генов, все еще остаются неизвестными. В дополнение к специфическим регуляторным механизмам, таким, как индукция амилазы декстринами или мальтотриозой и углеродно-метаболитное регулирование амилазы или агаразы, вероятно, происходит снятие подавления образования нескольких внеклеточных энзимов, поскольку после снижения питания унаблюдались одновременное продуцирование нескольких энзимов, разлагающих полимерные субстраты. Такие трансактивирующие регуляторные гены были обнаружены у(.. 169 324 - 333, 1987),(. . 166 20 - 28, 1986),. Позитивные регуляторные гены, воздействующие на синтез энзимов и/или секрецию, могли клонироваться при поиске повышенной секреции внеклеточных энзимов у слабо секретирующих штаммов, как .. Системы для экспрессии чужеродных последовательностей ДНК вранее были описаны, например в заявке на Европейский патент 148.552 и заявке -88/07079. Эти системы используют эндогенные промоторы внеклеточных энзимов, продуцируемых . Изобретение в первую очередь относится к фрагменту ДНК, кодирующему -полипептид, и полипептиду, который является фактором активации вторичного метаболизма. -полипептид непосредственно или опосредованно изменяет экспрессию генов внеклеточных энзимов упутем взаимодействия с регулирующей областью структурного гена внеклеточных фрагментов. Изобретение также относится к рекомбинантным плазмидным ДНК, определяющим экспрессию полипептида, штамму грибов, содержащему рекомбинантную плазмидную ДНК 3, и способу экспрессии -полипептида. Фрагмент ДНК, кодирующий -полипептид, получают путем молекулярного клонирования из бактерийАТСС 10137 он имеет следующую структуруАТС ТССАССТССССС САСТССССС. Указанный фрагмент ДНК обнаружен у всех исследованных грибов , что указывает на важную роль, которую играет соответствующий ген в метаболизме стрептомицетов. -полипептид содержит 113 аминокислот и имеет следующую структуру. Исследование транскрипции-трансляциипри использовании .показало, что в этом случае образуется белок правильного размера с мол. массой около 15000 дальтон. -полипептид имеет сильный положительный заряд (18 положительно заряженных аминокислот) и не обнаруживает состава, характерного для лидерного пептида или трансмембранного белка, и поэтому представляется маловероятным его непосредственное воздействие на секрецию белка. Положительно заряженный белок может легко взаимодействовать с ДНК. Действительно, в -полипептиде обнаружена ДНК-связывающая область, типичная для нескольких регуляторных белков (. . . 53293 - 321, 1984). Неожиданно было обнаружено, что-промотор более эффективен, чем природный промотор внеклеточных ферментов. Например, при экспрессии гена амилазы образуется больше амилазы, когда -промотор заменяет природный амилазный промотор. Таким образом, -промотор может быть использован вместо природного промотора для повышения экспрессии любого эндогенного полипептида или белка.-полипептид обладает плейстропным действием, т.е. воздействует более чем на один путь синтеза внеклеточных ферментов, а также на образование пигментов и на дифференциацию. В соответствии с изобретением достигается повышенное образование эндогенных (внеклеточных) белков. Более широко фрагмент ДНК, кодирующий -полипептид (-ген), и соответствующий полипептид могут быть использованы для увеличения экспрессии выбранных гетерологичных белков в стрептомицетах 3186 1 путем инсерции гена, кодирующего желаемый белок в подходящий сайт расщепления гена, кодирующего внеклеточный фермент, экспрессия которого усиливается за счет . Затем хозяйские клетки стрептомицетов, содержащие -ген, трансформируют рекомбинантным геном и культивируют трансформированные клетки с получением секретируемого продукта. Предпочтительно, гетерологичная ДНК под контролем промотора интегрируется в хромосомную ДНК и совместно с ней интегрируется вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую -полипептид. Вектор экспрессии не требуется интегрировать в хромосомную ДНК.-ген имеет промотор без -10 и -35 консенсусных последовательностей и связан с петлевыми структурами, которые могут функционировать как терминаторы транскрипции. Для экспрессии -полипептида используются различные рекомбинантные плазмидные ДНК. Одна из них содержит фрагмент ДНК плазмиды 702, включающий ген устойчивости к тиострептону и ген е, кодирующий тирозиназу. Другая плазмидная ДНК содержит фрагмент плазмиды 699, включающий гены устойчивости к тиострептону, биомицину и канамицину. При этом обе плазмиды содержат последовательность ДНК из,включающий фрагмент ДНК, кодирующий -полипептид, и при необходимости промотор генаследующей структуры. Рекомбинантная плазмидная ДНК 3, определяющая экспрессию -полипептида, содержит следующие конструктивные элементы последовательность ДНК из .АТСС 10137 размером 1 т.п.н., включающую фрагмент ДНК, кодирующий -полипептид, и промотор гена , структура которых указана выше фрагмент ДНК плазмиды 702, включающий ген устойчивости к тиострептону, и ген Ме, кодирующий тирозиназу. Рекомбинантная плазмида ДНК 300, определяющая экспрессию -полипептида, содержит следующие конструктивные элементы последовательность ДНК из .размером 1 т.п.н., включающую фрагмент ДНК, кодирующий-полипептид, и промотор гена , структура которых указана выше фрагмент ДНК плазмиды 19, включающий промотор гена. Для экспрессии -полипептида клетки микроорганизма трансформируют генетической конструкцией,содержащей фрагмент ДНК, кодирующей -полипептид. Трансформированные клетки выращивают в подходящей питательной среде и выявляют экспрессию -полипептида. В частности, плазмидную ДНК 3 вводят в клетки грибов. Полученный штамм характеризуется культуральноморфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, характерными для стрептомицетов,которые относятся к грамположительным, аэробным почвенным грибам. Изобретение поясняется чертежами, на которых фиг. 1 - карты рестрикции фрагментов хромосомной ДНК клонов .АТСС 10137 поП сайту плазмиды 702, которая содержит генетическую детерминанту для сверхпродукции щелочной фосфатазы фиг. 2 - результаты анализа (Саузерн - гибридизация) гомологии междут.п.н.11 фрагментом 3 и геномной ДНК других видов(А) фрагменты ДНК, полученные расщеплением 1 геномных ДНК (полосы 2 - 7). (В) Гибридизация ДНК, показанных на (А), с фрагментом величиной 1 т.п.н. в качестве образца (зонда). Полосы 1. ДНК, перевареннаяс получением фрагментов размерами 23, 9,59, 6,68, 4,29, 2,28, 1,94 и 0,58 кб 2. .3. .4. . - 1157 5..2212 6. .3570 7. .1326 фиг. 3 - опыты по испытанию на чашках Петри протеазной (А), амилазной (В) и липазной (С) активности. , трансформированных 702 (слева) и трансформированных 3 (справа) фиг. 4 - эффект дозы гена на экспрессию -гена. Продуцирование протеазы (А) и амилазы (В) . , трансформированными 702 (слева), . , трансформированными 3 (в середине), и. , трансформированными 30 (справа) фиг. 5. - Тримминг -гена. 1 т.п.н.фрагмента 3 использовался в качестве исходного материала. Образование внеклеточного фермента для всех плазмидных конструкций определялось на чашках с твердой средой, как указано в описании - означает продуцент дикого типа, два, три или четыре креста указывают различные степени сверхпродукции. Короткие открытые стрелки показывают локализацию и направление транскрипции гена тирозиназыв составе плазмиды 702. Закрытые кружки обозначают промотор -гена открытые (светлые) кружки отражают активность (по часовой стрелке) предполагаемого 3186 1 промотора в составе плазмиды 702, а открытые квадраты обозначают -промотор. Направление транскрипции показано стрелками. 1 соответствует рамке считывания , выведенной на основе нуклеотидной последовательности (фиг. 6) фиг. 6 - 9 - нуклеотидная последовательностьт.п.н.фрагмента 3 и выведенная на ее основе аминокислотная последовательность продукта -гена. Подчеркнут второй предполагаемый инициаторный кодон . Инвертированные комплементарные повторяющиеся последовательности показаны сходящимися стрелками. Волнистая линия отмечает аминокислотную последовательность, подобную ДНКсвязывающим областям известных ДНК-связывающих белков. Показаны подходящие сайты рестрикции. Нуклеотиды пронумерованы, начиная от сайта(нумерация справа) фиг. 10 - сравнение участка выведенной аминокислотной последовательности продукта генас ДНКсвязывающими областями известных ДНК-связывающих белков. Данные взяты уи , . .., 53293 - 321, 1984 ии ,, . 41, изд. Плива, Загреб, Югославия, 1986 фиг. 11 - повторные нуклеотидные последовательностиипо отношению к -гену фиг. 12 - повторяющиеся нуклеотидные последовательности генафиг. 13 - схематическое изображение плазмиды 2921. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Штаммы бактерий и плазмиды. При осуществлении изобретения использовались штаммыи,(Дифко) илис добавлением 34 сахарозы и 5 мМ 2 ( и др.. Лабораторный учебник, изд., Норвич, Великобритания,1985). Штаммывыращивали в тройных перегороженных флаконах при 28 С в ротационном шейкере при его вращении со скоростью 220 об/мин. Штаммы .выращивали в бульоне(см. Миллер и др.,стр. 433,. Нью-Йорк, 1972) или агпри 37 . Исследование ферментов на чашках Петри. Исследованиена щелочную фосфатазу проводили на среде(ММ) без глюкозы, содержащей пониженный уровень (1 мМ) фосфотазы, с добавлением 30 мкг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат-р-толуидина (ХР). Колонии, продуцировавшие щелочную фосфотазу, были синие, а неспособные к ее образованию - белые. Для .использовали среду,которая содержит (на 1 л) 10 г бактопектона 12 г основания Трисма 10 г 20 г агара Дифко рН 7,5 и 40 мкг/мл ХР. Амилазную активность колонийопределяли на среде ММ (без глюкозы) с добавлением 1 крахмала. После 3 дней роста чашки обрабатывали парами иода. Зоны просветления вокруг колоний возникают вследствие разложения крахмала. Липазную активность измеряли путем выращиванияв среде ММ с добавлением 2(вес/об.) оливкового масла, 0,5 (вес./об.) Твина 80 и 0,5(вес./об) Твина 20. После 20 дней роста в чашки добавляли по 1 мл 1 2. Образование липазы наблюдали в виде преципитата комплекса Са 2 - жирная кислота ( и др ., 64363 - 371, 1986). Протеазную активность исследовали в среде ММ (без глюкозы) с добавлением 0,5 казеина и 10 мМ 2. Ферментативную активность определяли как зоны осветления вокруг колоний. Агарозную активность .определяли в среде ММ без глюкозы с заполнением чашек Грамиодным раствором. Бета-галактозидазную активность наблюдали в виде синего окрашивания колоний, растущих на ММ без глюкозы с добавлением - (36 мкг/мл) и(10 мкг/мл). Выделение ДНК. Общую ДНК изполучают как описанои др., Лабораторный учебник (см. выше). Плазмидную ДНК изили .выделяют по методу Кизера ( и др., 1219 - 36, 1984). Процедуры клонирования. 10 мкг хромосомной ДНК штамма АТСС 10137 .и 0,5 мкг 702 полностью расщепляютП и лигируют в течение 12 ч при 14 С с использованием Т 4 ДНК-лигазы. Лигационную смесь используют непосредственно для трансформации. Субклонирование фрагментов ДНК проводят путем расщепления 1 - 2 мкг плазмидной ДНК адекватным рестрикционным ферментом (ферментами),а продукты реакции разделяют гель-электрофорезом в агарозе с низкой температурой . Требуемые полосы ДНК экстрагируют методом, подразумевающим использование СТАВ ( и др., .., 103264 - 272, 1980). Методы трансформации. Штаммытрансформируют как описано Хопвудом и др. в Лабораторном Руководстве (см. выше). После трансформации протопласты помещают на среду 2 У и оставляют регенерировать в течение 15 - 20 ч при 30 С. Затем в чашки добавляют 1 мл водного раствора тиострептона(300 мкг/мл), высушивают 1 или 2 ч и инкубируют в течение 2 или 3 дней. Трансформанты переносят на среду , содержащую тиострептон (50 мкг/мл) и ХР (30 мкг/мл). 3186 1 Трансформацию .осуществляют согласнои др. (. . . . США, 692110 - 2114,1972). Трансформанты подвергают селекции на чашках, содержащих ампициллин (200 мкг/мл). В случае необходимости вчашки добавляют - (36 мкг/мл) и(10 мкг/мл). Исследование гибридизации. Перенос ДНК с агарозного геля на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизацию проводят как описано Хопвудом и др. в Лабораторном Руководстве (см. выше). 7,2 т.п.н.Пфрагмент плазмиды 1 и 1 т.п.н. фрагментП плазмиды 3 используют в качестве зондов. Гибридизацию осуществляют при 70 С в течение 24 ч. Фильтры промывают дважды по 30 мин в 2 г ,0,1 и затем еще два раза по 30 мин в 0,2 ги 0,1 при 70 С. Анализ нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность определяют методом терминации цепи по Сэнгеру ( и др., . . . , США, 745463 - 5467, 1977). Фрагменты ДНК субклонируют в М 13 мр 10 и М 13 мр 11 для получения вставки в любой ориентации. Лигационные смеси трансформируют в компетентные клетки штамма 103 .и белые (гемолитические) бляшки скринируют для селекции вставок. Осуществляют секвенирование обеих цепей с использованием набора. (Великобритания) и набора Секвеназа (Биохимическая корпорация Соединенных Штатов). Все фрагменты секвенируют с использованием , но при необходимости также используютвместо. Реакционные смеси разделяют в 6 - или 8 -ных полиакриламидных гелях для секвенирования и затем экспонируют на рентгеновской пленке с целью авторадиографии. Клонирование промоторов. Фрагменты с активностью инициации транскрипции отбирают с использованием мультикопийной плазмиды 486 ( и др. . . ., 203468 - 478, 1986). Трансформанты с резистентностью к канамицину (Км) выделяют путем переноса колоний в среду ММ, содержащую 15 мкг/мл Км. Транскрипция-трансляция. Плазмиды 300 и 19 транскрибируют и транслируют с использованием набора лабораторных средств для направленной трансляции прокариотической ДНК ( . .)./35 / - метионин используют в качестве радиоактивной метки. Для анализа меченых белков используют 12,5 полиакриламидные гели, содержащие додецилсульфат натрия. Образование щелочной фосфатазы различными . На нескольких твердых средах исследуют продукцию щелочной фосфатазы десятью различными штаммами(см. табл. 1). .3570 и .АТСС 10137 оказались лучшими продуцентами на всех средах. Лучшей твердой средой для образования щелочной фосфатазы была среда(содержащая 30 мкг/мл ХР). В этой среде .3570 и .АТСС 10137 демонстрируют темно-синее окрашивание после 48 ч роста. . 1326 и .12280 являются продуцентами щелочной фосфотазы через 20 часов роста на ,содержащей ХР, наблюдается только светло-голубое окрашивание. Клонирование гена, вовлеченного в продуцирование щелочной фосфотазы. Общую ДНК от штамма АТСС 10137 .расщепляютП, лигируют с расщепленнойП плазмидой 702 и лигационную смесь вводят путем трансформации в протопласты .1326. Трансформанты переносят на среду, содержащую тиострептон (50 мкг/мл) и ХР (30 мкг/мл). Одну темно-синюю колонию обнаруживают среди 2,800 меланин-негативных трансформантов . . Эта темно-синяя колония содержит производное 702, включающее 7,2 т.п.н.П вставку и обозначенное 1 (см. фиг. 1). Плазмида 1 - .нестабильна и при ретрансформации определяет образование белых и синих колоний. Все синие колонии, содержащие исходную плазмиду 1, и белые колонии, содержащие дефектную форму (с делецией) плазмиды 1, далее не исследуют. Поскольку нестабильность могла быть вызвана большим размером вставки в такой плазмиде, как 702, которая известна некоторой нестабильностью, то 7,2 т.п.н. вставку субклонируют в 5 т.п.н.П фрагмент плазмиды 699 ( и др, 6583 - 91, 1988). Получают две плазмиды, 100 и 101 со вставкой, ориентированной в противоположных направлениях. Обе плазмиды стабильны, и ген экспрессируется в .в обеих ориентациях. Локализация -гена. 7,2 т.п.н.П фрагмент частично расщепляют с помощью , ЗА 1 и лигируют сП расщепленной плазмидой 702. Лигационной смесью трансформируют протопласты .и трансформанты переносят на среду , содержащую ХР. Плазмидную ДНК выделяют из нескольких синих колоний. Изучают подробно четыре небольшие плазмиды 2, 3, 16 и 18, несущие детерминанту образования щелочной фосфатазы эти плазмиды стабильны при ретрансформации в протопласты .и включают вставки размером 2,4, 1, 2,1 и 1,9 т.п.н. (фиг. 1) соответственно. Плазмида 3 содержит самую маленькую вставку размером 1 т.п.н., которая может быть вырезана с помощьюП. Будучи введенной в . , 3 повышает образование щелочной фосфотазы, как и 1. 3 депонирована с регистрационным номером 1 - 859 19.05.89 в Национальной коллекции Культур Микроорганизмов согласно Будапештскому Договору и Правилу 28 ЕРС. Гибридизация с хромосомной ДНК нескольких . Общую ДНК из штамма АТСС 10137 . 3186 1 ник-трансляцией с (32 р) . Гомологичный этому зонду 7,2 т.п.н.П фрагмент обнаруживается в ДНК штамма АТСС 10137 . , расщепленныйП, как и ожидалось. В этом фрагменте находится сайт 1, который определяет образование двух четких полос гибридизации (размером 7,9 т.п.н. и 9,4 т.п.н.), когда остальную ДНК расщепляют 1. Для выяснения, тот ли же самый ген присутствует в других , общую ДНК . , .- 1157, .2212, .3570, .1326 и .3802, расщепляюти гибридизуют ст.п.н.П фрагментом в качестве зонда. Гибридизацию с 9,5 т.п.н. с общей полосой наблюдают у первых четырехштаммов стрептомицетов (см. выше) тогда, как в ДНК .и .обнаруживают 4 и 5 слабых полос гибридизации, соответственно (фиг. 2). Кроме того, регистрируют гибридизацию ДНК ., .12280, .3585 и .АТСС 10475. Дальнейшие попытки охарактеризовать полосы гибридизации не предпринимаются. Некомплементарность -мутантов . . Была сделана попытка установить некомплементарность Е.-мутантов Е 15 и А 1046 при клонировании структурного гена щелочной фосфатазы штамма АТСС 10137 . . 7,2 т.п.н.П фрагмент 1 ит.п.н.П фрагмент 3 субклонировали раздельно в обеих ориентациях в 1 расщепленной 19. Все плазмидные конструкции тестировались в клетках .М 103 и затем использовались для трансформации .Е 15 ( и др., ., 145288-292, 1981) и .1046. В В-ХР не было обнаружено никаких синих колоний это позволяет предположить, что полный структурный ген щелочной фосфатазы не присутствует в 7,2 т.п.н. фрагменте .или что этот ген не экспрессируется в . . Структурный ген щелочной фосфатазыили(. , 158978 - 982,1984) не гибридизовался с клонированным 1 т.п.н. фрагментом (данные не приведены). В дополнение,(регулярный) .мутант Н 2 ( и др., , 81 459-468, 1975) не был комплементирован ни ст.п.н.П фрагментом 3, ни 7,2 П фрагментом 1. Суперпродукция других внеклеточных энзимов. Когда 3 используют для ретрансформации протопластов ., то наблюдается ясная отложенная (т.е. с задержкой) пигментация и споруляция. Как показано на фиг. 3, некоторые внеклеточные ферменты, включающие амилазу, протеазу и липазу, сверхпродуцируются . , трансформированным с помощью 3. Образование бета-галактозидазы также увеличивается, начинаясь примерно на 24 - 30 ч ранее, чем у нетрансформированного . . Благодаря плейотропным эффектам клонированного гена на внеклеточные ферменты, образование пигмента и дифференцирование, этот ген был назван(т.е. фактор активации вторичного метаболизма). Эффект дозы гена. Количество копий р 702 оценивают как около 100 - 200 на хромосому. Хотя точное количество копий 3 не было определено, интенсивность обеих полос 702 и 3 позволяет предположить сходное количество копий. С целью изучения эффекта дозы гена субклонируют 1 т.п.н.фрагмент 3 по сайту 1 плазмиды 61 с малым количеством копий (от 3 до 4 копий на клетку) (см. Хопвуд и др., Лабораторное Руководство). Новую плазмиду обозначают 30. На фиг. 4 показано, что образование внеклеточных ферментов . , трансформированным 30, отчетливо понижается по сравнению с . , содержащим 3. Кроме того, . , включающие 30, продемонстрировали сходный характер образования пигментов и споруляций, как и нетрансформированные . . Экспрессия в .и тримминг гена. Хотямутанты .не комплементировались -геном,т.п.н. 1 П вставка 3, будучи субклонирована в одном направлении в 19 (плазмида, обозначенная 300), экспрессировалась в ., вызывая измененную морфологию при росте на твердой среде, но не экспрессировалась при встраивании в обратном направлении (плазмида 302). Плазмида 300 содержит(см. ниже) в направленииотпромотора. Эти результаты позволяют предположить, что -ген экспрессируется в .промотора, входящего в состав 19. Исследования транскрипции-трансляции в .(с плазмидой 300) проводят такжеи продукты реакции наслаивают на 12,5 -ный полиакриламидный гель. Полоса мол. массы 15000 присутствует на дорожке, соответствующей 300, и отсутствует в контрольной дорожке 19. Для точной локации -гена продолжают расщепление 1 т.п.н. фрагмента плазмиды 300. При этом используют уникальные сайты для ферментов рестрикции /216/,/648/ ц 1 /936/ в пределах 1 т.п.н. - фрагмента. Различные субфрагменты на 1 т.п.н. - вставки 300 клонируют на первой стадии в 2921, производное 18, содержащее модифицированный полимер, фланкированныйП сайтами (см. фиг. 13), и затем высвобождают с помощьюП липкие концы и клонируют вП расщепленную плазмиду 702. Образование щелочной фосфатазы, амилазы и протеазы изучали усо всеми плазмидными конструкциями. Результаты этих исследований показаны схематично на фиг. 5. На основании приведенных результатов можно сделать следующие заключения 3186 1 1. 1 т.п.н. - фрагмент содержит полный -ген, включающий свой собственный промотор, поскольку он экспрессируется на сходном уровне в обеих ориентациях плазмиды 702 (плазмиды 3 и 4). 2. Указанный -ген, вероятно, расположен в 648-нуклеотидномП-Кр 1 фрагменте (плазмиды 5 и 6) 3. Фрагмент - (432 нуклеотида), вероятно, содержит генетическую детерминанту для сверхпродукции внеклеточного фермента, но, по-видимому, утратил область промотора, поскольку экспрессируется только в одной ориентации (плазмида 14 и 10), но не в противоположной (плазмиды 9 и 13). 4. 215-нуклеотидный фрагментП - 1 содержит область промотора -гена. 5. Все эффекты на внеклеточные ферменты и дифференцировку сохраняются и утрачиваются вместе, указывая на то, что они обусловлены продуктом одного гена. 6. Неожиданным оказалось отсутствие экспрессии фрагмента - (-ген без промотора) с промотора тирозиназы -гена, присутствующего в 702, который тем не менее экспрессировался в противоположном направлении (по часовой стрелке). Это открытие позволяет предположить, что существует фрагмент с промоторной активностью, расположенный перед -геном в 1 П клонирующего сайта. Возможность функционированияв обратном направлении (от 1-1) была отброшена по нескольким причинам А. Такаяне была обнаружена при анализе нуклеотидной последовательности. В. Если бы такаясуществовала, то ясно, что она имела бы свой собственный промотор, поскольку фрагмент П-1 (1 - 648 н.п.) экспрессировался в обоих направлениях (плазмиды 5 и 6). Кроме того, выглядит бессмысленным, чтобы -1 фрагмент, который имеет промотор в области 1,мог экспрессироваться только в одном направлении. С. Экспрессия в .всегда происходит, когда промоторнаходится перед предполагаемой , и никогда - при его расположении в обратном направлении. Промоторная активность 1 фрагмента ДНК в положении . Из предыдущих экспериментов можно сделать вывод, чтоП- фрагмент содержит ген, который кодирует амино-гликозидфосфотрансферазу (ео), без промотора. Экспрессия этого гена придает .резистентность к канамицину и неомицину. Когда этот фрагмент субклонируют в р 486 (с 1 концом,ближайшим к ео-гену) то получают плазмиду 484216. Наблюдают, что . , трансформированный 486216, растет в ММ с содержанием канамицина более 100 мкг/мл, тогда как . , трансформированный 486, не растет на ММ с добавлением канамицина в количестве 5 мг/мл Эти результаты показывают, что указанный фрагмент имеет промоторную активность, и подтверждают существование предполагаемой . Другие заключения, которые можно сделать на основе нуклеотидной последовательности вероятной, включают следующее 1. Генокружен двумя областями с инвертированными и комплементарными повторными последовательностями, которые могут образовывать в мРНК очень стабильные связи- 38,4 Ккал (нуклеотиды 637 - 697) (фиг. 8). 2. Секвенированный фрагмент содержит высокийС процент, что характерно для генов . 3. Перед геноммежду АТС - (нт 219) и повторяющимися структурами в положенииимеется очень интересная нуклеотидная область в ней обнаружены 3 пары повторяющихся нуклеотидов (каждый составляет 7 нт) (фиг. 12). Весьма вероятно, что эта область, особенно промоторная зона, играет очень важную роль в регуляции экспрессии гена . 4. Следует упомянуть о том, что -полипептид содержит 18 суммарных положительных зарядов. Исходя из теоретических положений, это предполагает существование значительно большей аффинности к ДНК. Даже в выведенной аминокислотной последовательности можно было наблюдать область, сходную с областями ДНК-связывающих белков ( и , 1884) (фиг. 10). Нуклеотидная последовательность -гена. Нуклеотидную последовательность целойт.п.н. 1 П вставки 3 определяют с использованием плазмиды 300 в качестве исходного материала. Поскольку М 13 р 10 и М 13 р 11 не имеютсайта, фрагменты с -концами сначала субклонируют в 19 и затем высвобождают в виде 1 -фрагментов и вводят в мр 10 и мр 11 расщепленныеи. Полная нуклеотидная последовательность активной области показывает наличие 1 из 339 нуклеотидов, которые кодируют предполагаемый-полипептид (фиг. 6 - 9). При этом имеется только одна возможная открытая рамка считывания, содержащаяП-Кр 1 фрагмент, начинаясь от -кодона инициации у нуклеотида 183 и заканчиваясьстоп-кодоном у нуклеотида 524 (1 на фиг. 5 - 9). Поскольку -1 вставка, содержащаяся в плазмиде 14, демонстрирует более низкую степень активности, чем плазмиды, также содержащие областьсайта в положении(3, 4, 5 и 6), очень вероятно, что АТ-(нуклеотид 219) в пределах предполагаемой рамки считыванияможет функционировать как кодон инициации в 10 и 14. Никакие другие альтернативные триплеты инициации невозможны, посколькуко 3186 1 дон терминации обнаружен в положениипо отношению к первому . Длинная инвертированная повторяющаяся область, которая может образовывать очень стабильную стеблевую и петлевую структуру (- 53,6 Ккал), присутствует в положениипо отношению к -гену, от нт 90 до нт 135. Другая инвертированная повторяющаяся последовательность обнаруживается в положениитерминаторного триплета 1, простираясь от нт 637 до 697 (-38,4 Ккал). Генимеет высокоеС содержание (76,3 ). Описание раскрывает общую сущность изобретения при этом любые возможные модификации не выходят за рамки изобретения. Ниже приведены штаммы и плазмиды, используемые для осуществления изобретения (табл. 1 и 2). Таблица 1 Бактериальные штаммы Обозначение штамма Соотв. характеристика Ссылка на источник,15 2 1 Коллекция микроорганизмв Института, Великобритания,4 ,. АТСС Американская Коллекция типов культур.Уаксмановский Институт микробиологии и Рутгеровский Университет, США, штат Нью-Джерси,г. Нью-Брунсвик.Исследовательские Лаборатории Северного Региона, Пеория, штат Иллинойс, США.Центр генетического фонда . . Таблица 2 Плазмиды и фаги Обозначение Соответствующие характеристики Источник 702 тиострептоновая резистентность и меланин 3 699 резистентность к тиострептону, биомицину и канамицину 4 61 резистентность к тиострептону и неомицину 5 486 резист. к тиострептону и -ген без промоторов 6 серия векторыи . с, несущие -ген и/или смежные заявка последовательности 486216 486, несущий область-промотора заявка 197,13 м 0 и мр 11 фаги для генерирования одноцепочечной ДНК 8 1 и 200 векторы , несущие ген амилазы заявка 220 вектор , несущий ген промотора заявка 10 вектор , несущий ген амилазы с- промотором заявка 1 вектор , несущий ген амилазы с ра - промотором заявка 80 вектор , несущий ген амилазы с К - промотором заявка(резистентности к канамицину) 150 вектор , несущий ген амилазы с- промотором заявка Ссылки, цитируемые в таблицах 1 и 2. 1. , ,. . 1985.. . . . .825107-5111. 2. , ., . , . 1981.. . . . Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.