Экстракт для агглютинации Chlamydia psittaci, ротавируса, вируса диареи или вируса инфекционного ринотрахеита

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ЭКСТРАКТ ДЛЯ АГГЛЮТИНАЦИИ,РОТАВИРУСА, ВИРУСА ДИАРЕИ ИЛИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА(71) Заявитель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию(72) Авторы Кубарев Валерий Степанович Шишлов Михаил Петрович Красочко Петр Альбинович Добровольский Сергей Александрович(73) Патентообладатель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию(57) Применение экстракта из проросших семян люпина желтого, полученного путем экстрагирования семян 2 -ным раствором хлористого натрия в течение 20 часов при температуре 20 С, в качестве средства для агглютинации, ротавируса, вируса диареи или вируса инфекционного ринотрахеита. Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицине и ветеринарной медицине, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового класса и методов диагностики заболеваний вирусной этиологии. В настоящее время наиболее доступными и известными методами лабораторного обнаружения вирусов в патологическом материале являются методы иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа, реакции диффузной преципитации или непрямой гемагглютинации с использованием иммуноглобулинов 1. Кроме того, получает распространение метод ДНК-типирования, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (метод ПЦР), с выявлением особенностей ДНК-возбудителя и его идентификации. Для профилактики и терапии вирусных инфекций и хламидиоза крупного рогатого скота наиболее широко распространенными являются средства специфической пассивной профилактики - сывороточные или иммуноглобулиновые препараты 2. В качестве аналога изобретения могут быть приняты методы серологической диагностики с использованием белков иммунного ответа - иммуноглобулинов и моноклональных антител. К недостаткам вышеуказанных методов относится то, что получение моноклональных антител является очень трудоемким процессом, а это, в свою очередь, резко по 12605 1 2009.12.30 вышает их стоимость. Так, процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы иммунизация животных, выделение клеток, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор продуцирующих специфические антитела клонов, клонирование и реклонирование, массовая наработка гибридомных клеток, получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела, и выделение этих антител. Как правило, вся процедура от начала до выделения антител занимает около 3-4 месяцев 3. Также для профилактики и терапии вирусных инфекций и хламидиоза крупного рогатого скота наиболее широко используют средства специфической пассивной профилактики - сывороточные или иммуноглобулиновые препараты. Однако их широкое применение тормозится из-за их высокой стоимости, а также возможности перезаражения опасными инфекционными заболеваниями - лейкозом, губкообразной энцефалопатией и т.д. В настоящее время средств терапии вирусных инфекций для человека и животных крайне мало. К таким препаратам относятся ремантидин, абоктан Р и абоктан Д, рифампицин и т.д. Эти химиотерапевтические препараты обладают высокой токсичностью и высокой стоимостью. Кроме того, при использовании они ухудшают качество продукции. Так как вирусы не имеют клеточного строения, то вышеуказанные лекарственные препараты воздействуют как на инфицированную клетку, в которой репродуцируется вирус, так и на здоровую клетку 4,5. Задача изобретения - упрощение лабораторной диагностики инфекционных заболеваний вирусной этиологии и хламидиоза молодняка сельскохозяйственных животных. Поставленная задача решается использованием экстракта из проросших семян люпина желтого в качестве средства для агглютинации, ротавируса, вируса диареи или вируса инфекционного ринотрахеита. Применение данного вещества снижает денежно-трудовые затраты при сохранении точности полученных результатов. Исходя из того, что в сухих семенах присутствует смесь лектинов комплементарных различным углеводным детерминантам патогенных микроорганизмов, то после проведения их очистки возможно получение химического препарата, обладающего свойством иммуноглобулинов, при этом превосходящего их по способности образовывать комплексы с антигенами. Для исследований использовали семена зерновых и бобовых культур, из которых были получены грубые водные экстракты легкорастворимых белков, содержащих лектины. Экстрагирование лектинов проводили из гомогенизированной муки размолотых семян 2 -ным раствором хлористого натрия настаиванием в течение 20 часов при температуре 20 С. Гомогенаты центрифугировали и далее фильтровали через бумажный фильтр. Полученные экстракты хранились в холодильнике при температуре 4 С. В эксперименте использовались экстракты как в концентрированном, так и в разведенном виде в дистиллированной воде в соотношении 110. Для получения экстракта использовали как проросшие до состояния видимого проростка, так и сухие семена. Экстракты лектинов наносили на планшет, куда затем вносили исследуемые инактивированные штаммы микроорганизмов, вируса диареи , ротавируса, вируса инфекционного ринотрахеита . Для сравнения гемагглютинирующей активности лектинов использовался контроль из стабилизированных эритроцитов крупного рогатого скота. Для дифференцирования реакции агглютинации лектинами хламидий и вирусов, а не компонентов среды стабилизатора, в котором они находятся, использовался контроль из пробы этой среды, свободной от штаммов микроорганизмов. Оценку степени агглютинации проводили визуально. Изучение действия экстрактов растений на патогенные микроорганизмы подтвердило их способность к агглютинации некоторых из них. Агглютинация лектинами компонентов среды контроля отсутствовала. Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что 12605 1 2009.12.30 лектины используемых в эксперименте сухих семян растений не комплементарны углеводным детерминантам ротавирусов. Наиболее интенсивная агглютинация микроорганизмов .и вирусов инфекционного ринотрахеитабыла вызвана лектинами сухих семян желтого люпина, а вирусов диареи- лектинами фасоли белой. Агглютинация ротавирусови вирусов инфекционного ринотрахеиталектинами, полученными из сухих семян фасоли вьющейся, была очень слабая, но активная - хламидий. Следует отметить, что лектины вышеназванных культур оказались способны вызывать активную агглютининацию вирусов диареи. Лектины ячменя показали специфичность только к углеводным детерминантам эритроцитов, проявляя при этом очень слабую гемагглютинирующую активность. Лектины сухих семян сои оказались специфичными как к хламидиям, так и к эритроцитам крови. Согласно данным, приведенным в табл. 2, следует, что при использовании экстракта,содержащего лектины из проросших семян, были получены противоположные данные по действию лектина семян желтого люпина на ротавирусы, так как в этом случае наблюдалась агглютинация. Такой же эффект был получен при оценке агглютинирующей способности лектинов из проросших семян фасоли белой. Значительного увеличения или снижения активности лектинов, полученных из проросших семян фасоли вьющейся, к исследуемым хламидиям и вирусам (за исключением увеличения агглютинирующей способности к вирусу инфекционного ринотрахеита) не выявлено. Это позволяет сделать выводы о том, что при прорастании семян бобовых культур в них происходит синтез лектина, комплементарного ротавирусам. Способность лектинов агглютинировать хламидии при этом существенно не менялась. Выявлена ген-специфика агглютинации хламидий лектинами узколистного люпина. Экстракт из проросших семян сорта узколистного люпина Першацвет не агглютинировал хламидии. Наиболее активными агглютинантами патогенных микроорганизмов показали себя лектины, содержащиеся как в сухих, так и в проросших семенах бобовых культур, особенно лектины люпина и фасоли, которые при этом показали низкую гемагглютинирующую активность. В зависимости от того, были экстракты получены из проросших или сухих семян, агглютинирующая способность лектинов к патогенным микроорганизмам также варьировалась. При этом наблюдалось четкое избирательное действие лектина на исследуемые организмы, в результате которого они подвергались агглютинированию. При разведении полученных экстрактов в дистиллированной воде в соотношении 110 способность лектинов семян бобовых культур агглютинировать микроорганизмы .не снижалась, оставаясь на том же уровне, при этом гемагглютинирующая способность практически исчезла и визуально не фиксировалась. При проведении эксперимента с экстрактами лектинов, не подвергнутых термической обработке продолжительностью 5 мин при температуре 100 С, были получены отрицательные результаты в способности экстрактов вызывать агглютинацию. Это указывает на то, что агглютинацию вызывает компонент экстракта белковой природы и в результате термической обработки произошла его денатурация, после чего он потерял способность к образованию комплексов с гликоконьюгатами плазмолеммы хламидий, капсидами и нитями вирусов. Таблица 1 Реакция агглютинации лектинов бобовых культур,извлеченных из сухих семян бобовых культур Культура Соя Ячмень- степень агглютинации, - - отсутствие агглютинации, о - эксперимент не проводился,сорта Миртан и Першацвет - реакция идентична. Таблица 2 Реакция агглютинации лектинов, извлеченных из проросших семян бобовых культур, с патогенными микроорганизмами Культура Влияние концентрации растворов лектинов бобовых культур на реакцию агглютинации Соя Ячмень Фасоль вьющаяся Люпин Миртан Объект исисход- разве- исход- разве- исход- разве- исход- разведенследований ный денный ный денный ный денный ный ный Эритроциты- степень агглютинации - - отсутствие агглютинации. Таблица 4 Влияние термообработки лектинов бобовых культур на их агглютинирующую способность Культура Люпин желтый Фасоль штамбовая Фасоль вьющаяся Бобы кормовые Источники информации 1. Максимович В.В. Дифференциальная диагностика классической чумы свиней.- Мозырь КПУП Колор, 2001. 2. Красочко П.А., Жих Г.И., Иванова И.П. Определение иммуногенной активности экспериментальной поливалентной инактивированной вакцины против ИРТ, ВД, рота- и коронавирусной инфекции на лабораторных животных. Ученые записки Учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. Т. 41. Вып. 2. Ч. 1.- Витебск, 2005.- С. 28-29. 4 12605 1 2009.12.30 3. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф., Корженевская Т.Г., Маркарова Е.Н. Клеточная инженерия.- М. Высшая школа, 1987. 4. Красочко П.А., Ковалев Н.А., Красочко И.А., Колоницкая Е.Г., Иванова И.П.,Жих Г.И., Кот И.И. Профилактическая эффективность трехвалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и парагриппа-3 крупного рогатого скота. Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных. Материалы Междунар. научно-практ. конференции, посвящ. 70-летию БелНИИЭВ им. С.Н.Вышелесского, 56 октября 2000 г.- Минск БИТ Хата, 2000.- С. 115-117. 5. Красочко П.А., Красочко И.А., Кабась С.С., Иванова И.П., Жих Г.И. Иммуногенная эффективность поливалентной инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота. Ветеринарная медицина. Сборник, 2005. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5