Способ прогнозирования течения саркоидоза органов дыхания

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ САРКОИДОЗА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ(71) Заявители Государственное учреждение Научно-исследовательский институт пульмонологии и фтизиатрии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(72) Авторы Бородина Галина Львовна Котович Ирина Леонидовна Таганович Анатолий Дмитриевич Лаптева Ирина Михайловна Дюсьмикеева Марина Игоревна(73) Патентообладатели Государственное учреждение Научно-исследовательский институт пульмонологии и фтизиатрии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(57) Способ прогнозирования течения саркоидоза органов дыхания, отличающийся тем,что определяют содержание общего липидного фосфора в пробе индуцированной мокроты больного и при содержании в интервале от 55,67 до 92,13 мкМ фосфора в пересчете на 1 л мокроты прогнозируют неблагоприятное течение саркоидоза, а при содержании в интервале от 95,76 до 180,44 мкМ фосфора в пересчете на 1 л мокроты - благоприятное течение. Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиопульмонологии. Прогнозирование течения саркоидоза остается одной из самых сложных и важных задач в ежедневной клинической практике пульмонолога и фтизиатра. В связи с тем, что этиология саркоидоза окончательно не установлена, прогностические критерии процесса до сих пор являются предметом научных дискуссий. Широкое использование метода исследования бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛ) значительно расширило понимание клеточных и молекулярных основ патогенеза интерстициальных болезней легких, к которым относится саркоидоз, и позволило разработать новые способы прогнозирования заболеваний. Известен способ прогнозирования течения пневмофиброза легких, заключающийся в исследовании уровня фосфатидилхолина в бронхоальвеолярном смыве 1. Однако этот способ не позволяет прогнозировать течение саркоидоза органов дыхания. Этот недостаток преодолен в способе прогнозирования течения саркоидоза путем исследования фосфолипидного состава сурфактанта в бронхоальвеолярной лаважной жид 9444 1 2007.06.30 кости методом тонкослойной хроматографии и анализа содержания общего липидного фосфора 2. Однако, в связи с тем, что БАЛ получают только в процессе выполнения бронхоскопии, вышеуказанный способ связан с определенным риском для пациента, обладает рядом противопоказаний, достаточно сложен и требует оснащенности дорогостоящим оборудованием, что делает его непригодным для применения в амбулаторных условиях. Задачей заявляемого способа является повышение безопасности, возможность многократного получения материала, упрощение и удешевление способа при сохранении точности прогнозирования. Для достижения этих целей в качестве исследуемого биологического материала целесообразно было бы использовать мокроту пациентов, однако в большинстве случаев мокрота при саркоидозе спонтанно не отделяется. Предлагается использовать индуцированную мокроту, то есть полученную после ингаляции гипертонического раствора. Поставленная задача достигается тем, что в способе прогнозирования течения саркоидоза путем исследования уровня фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии и анализа содержания общего липидного фосфора (ОФЛ) - прогнозирование осуществлялось путем анализа уровня общего липидного фосфора в индуцированной мокроте, и при его содержании в интервале от 55,67 до 92,13 мкМ Р/л прогнозируют неблагоприятное течение саркоидоза, а при содержании ОФЛ в интервале от 95,76 до 180,44 мкМ Р/л - благоприятное течение процесса. При уровне ОФЛ ниже 55,67 мкМ Р/л выше 180,44 мкМ Р/л или в интервале от 92,13 до 95,76 мкМ Р/л - точность прогнозирования снижается. Заявляемый способ на основе исследования индуцированной мокроты отличается абсолютной неинвазивностью, простотой, безопасностью для пациента, отсутствием необходимости в дорогостоящем оборудовании. Сущность предлагаемого способа поясняется чертежом, где на фигуре по вертикальной оси - уровень ОФЛ в индуцированной мокроте 1 - уровень ОФЛ в индуцированной мокроте у контрольной группы, 2 - уровень ОФЛ в индуцированной мокроте у больных саркоидозом в целом, 3 - уровень ОФЛ в индуцированной мокроте у больных саркоидозом с благоприятным течением заболевания, 4 - уровень ОФЛ в индуцированной мокроте у больных саркоидозом с неблагоприятным течением заболевания. Различия между группами статистически достоверны. Способ осуществляется следующим образом Индуцированную мокроту получают путем ингаляции 3-5 гипертонического раствора с помощью ультразвукового небулайзера по методу.,, 1992 в модификацииТ,,., 1995 3. Исследование мокроты должно быть проведено не позднее 2 часов после получения материала, на протяжении всего этого времени образцы мокроты должны храниться при температуре 4 С. Качество материала оценивают на основании полученного объема мокроты и степени примеси к ней слюны. Наиболее подходящими для исследования считаются слизистые слепки размером более 4,59 мм с минимальными примесями слюны. Может потребоваться просмотр мокроты под инвертированным микроскопом, после чего отбирается материал с минимальным содержанием плоских эпителиальных клеток (менее 20 от всех клеток). Следующий этап - диспергирование и гомогенизация мокроты, для чего используют дитиотреитол (ДТТ) - вещество с низким окислительно-восстановительным потенциалом, разрушающее дисульфидные связи гликопротеинов слизистого секрета и не оказывающее влияния на клеточные и растворимые факторы мокроты. Раствор дитиотреитола готовится непосредственно перед исследованием, препарат разводится до 0,1 концентрации и добавляется к мокроте в соотношении 1 мл ДТТ на 1 мг мокроты. Смесь мокроты с ДТТ встряхивают в течение 10 минут, клеточную суспензию отмывают в сбалансированном солевом растворе Хенкса, фильтруют через нейлоновую марлю и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин. Для анализа растворимых факторов используют супернатант, полученный после центрифугирования. 2 9444 1 2007.06.30 Количественное определение фосфолипидов. Экстрагируют липиды, содержащиеся в индуцированной мокроте, по методу .и соавт. с использованием обычных растворителей 4. После разделения водной и липидной фракций верхний слой, содержащий водорастворимые соединения, отбрасывают. Нижний хлороформенный слой, содержащий липиды, упаривают под струей газообразного азота. Сухой осадок липидов растворяют в 0,2 мл хлороформа (Реахим, Россия). Полученный экстракт используют для разделения фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии и количественного определения общего липидного фосфора методом , , (1975) 5. Замер оптической плотности проб производят на СФ-26 (ЛОМО, Россия) при 815 нм. Количество фосфолипидов пересчитывают на 1 литр индуцированной мокроты и выражают в микромолях фосфора на литр индуцированной мокроты (мкМ Р/л). При уровне общего липидного фосфора в интервале от 55,67 до 92,13 прогнозируют неблагоприятное течение саркоидоза, а при содержании ОФЛ в интервале от 95,76 до 180,44 мкМ Р/л - благоприятное течение процесса. Были обследованы 60 пациентов с саркоидозом органов дыхания в возрасте от 20 до 55 лет (средний возраст - 30,25,3 лет). Все больные находились на стационарном лечении в клинике НИИ пульмонологии и фтизиатрии МЗ РБ. Диагноз саркоидоза был подтвержден морфологически. Медиастинальная форма саркоидоза наблюдалась у 28 больных, легочномедиастинальная форма - у 26, легочная форма - у 6. Контрольную группу составили 16 практически здоровых лиц. Проанализирована динамика заболевания у обследованных лиц в течение не менее 12 месяцев после выписки из стационара. Окончательный исход заболевания сопоставляли с данными, отражающими уровень липидного фосфора в индуцированной мокроте больных. Результаты представлены в табл.1. Таблица 1 Содержание общего липидного фосфора (мкМ Р/л) в индуцированной мокроте при саркоидозе Показатель Контроль,16 Больные саркоидозом,16 Общий липидный фосфор 219,241,4 106,523,5- р 0,05. В проведенных исследованиях установлено, что при саркоидозе органов дыхания в индуцированной мокроте, также как и в БАЛ, содержание уровня общего липидного фосфора сурфактанта существенно снижается по сравнению с контрольной группой(106,523,5 и 219,241,4 мкМ Р/л соответственно, р 0,05). Однако степень снижения этого показателя значительно отличалась в зависимости от характера течения саркоидоза. Результаты представлены в табл.2. Таблица 2 Содержание общего липидного фосфора (мкМ Р/л) в индуцированной мокроте в зависимости от характера течения саркоидоза Больные саркоидозом Показатель Неблагоприятное течение,Благоприятное течение,2634 Общий липидный фосфор 73,99,3 138,121,6- р 0,05. Неблагоприятное течение заболевания наблюдалось у пациентов с низкими показателями общего липидного фосфора (73,99,3 мкМ Р/л). В этой группе пациентов отмечалось частое рецидивирование процесса и развитие пневмофиброза, что приводит впоследствии к дыхательной недостаточности. Среди пациентов с относительно высоким уровнем общего липидного фосфора в индуцированной мокроте чаще отмечалась значительная положительная динамика в виде 3 9444 1 2007.06.30 рассасывания инфильтратов и уменьшения размеров внутригрудных лимфоузлов вплоть до полной нормализации рентгенологической картины. В этой группе пациентов за весь период наблюдения после выписки (12 месяцев) не наблюдалось случаев рецидивирования. В целом в группе больных с благоприятным исходом уровень общего липидного фосфора в индуцированной мокроте составил 138,121,6 мкМ Р/л. Для вероятностной оценки различия между данными для благоприятного и неблагоприятного течения процесса (уровни ОЛФ в индуцированной мокроте) были определены доверительные интервалы полученных показателей. Предполагается, что все данные по каждой из рассматриваемых групп имеют нормальное распределение признаков. По таблице для функции Лапласа находим ,1,96. С вероятностью 95 все искомые значения уровня ОЛФ находятся в интервале( -), где М - средняя величина,- ошибка средней величины. Таким образом, у больных саркоидозом с неблагоприятным течением процесса с вероятностью 95 искомые значения уровня ОФЛ в индуцированной мокроте находятся в интервале(55,67 а 92,13),а значения уровня ОЛФ у больных саркоидозом с благоприятным течением процесса с той же вероятностью находятся в интервале(95,76 а 180,44) Следовательно, при уровне ОФЛ в индуцированной мокроте в интервале от 55,67 до 92,13 мкМ Р/л можно прогнозировать неблагоприятное течение саркоидоза, а содержание ОФЛ в индуцированной мокроте в интервале от 95,76 до 180,44 мкМ Р/л свидетельствует о благоприятном течении процесса. Таким образом, анализ долгосрочной динамики саркоидоза у обследованных больных показал, что у пациентов с относительно высоким уровнем фосфолипидов в индуцированной мокроте (от 95,76 до 180,44 мкМ Р/л) значительно выше вероятность благоприятного исхода процесса с тенденцией к полной регрессии изменений в легких. В то же время значительное уменьшение содержания фосфолипидов в индуцированной мокроте при саркоидозе (от 55,67 до 92,13 мкМ Р/л) сопровождается прогрессированием саркоидоза с исходом в фиброз легких или развитием рецидивов процесса. Пример 1 Больная К., 1974 г. рождения, истории болезни 95 и 2678. Поступила в стационар 14.01.2003 г. по поводу саркоидоза органов дыхания, легочно-медиастинальная форма, ДН 0. При поступлении жалоб не предъявляла. При объективном обследовании общее состояние удовлетворительное, в легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца - ясные,ритмичные. Пульс 72 в минуту, АД - 120/80. Рентгенологическое обследование в верхних и средних отделах обоих легких элементы мелкоочаговой диссеминации на фоне усиленного интерстициального компонента, корни малоструктурны, левый несколько расширен за счет лимфоузлов. Общий анализ крови гемоглобин - 139 г/л лейкоциты - 5,8106 СОЭ 6 мм. рт. ст. клеточная формула не изменена. Биохимический анализ крови без патологии. В результате проведенного лечения самочувствие больной улучшилось, и при контрольном рентгенологическом обследовании через 28 дней было отмечено частичное рассасывание диссеминации и инволюция внутригрудной аденопатии. С целью прогнозирования дальнейшего течения саркоидоза использован предлагаемый способ определения прогноза заболевания на основе исследования уровня фосфолипидов в индуцированной мокроте(общий липидный фосфор - 65,2 мкМ Р/л). Результат данного анализа свидетельствовал о неблагоприятном течении процесса. В дальнейшем через 7 месяцев после выписки из стационара самочувствие больной ухудшилось, появился кашель, аускультативно в обоих 4 9444 1 2007.06.30 легких стали выслушиваться сухие хрипы, а на рентгенограмме зафиксировано ухудшение в виде резкого нарастания в обоих легких тяжисто-очаговой диссеминации. Корни легких остаются расширенными за счет лимфоузлов. Больная вновь была госпитализирована в стационар 20.11.2003 с диагнозом саркоидоз органов дыхания, легочно-медиастинальная форма, прогрессирование, ДН -0. Пример 2 Больная Д., 1975 г. рождения,истории болезни 517. Поступила в стационар 22.01.2002 г. по поводу саркоидоза органов дыхания, легочно-медиастинальная форма, ДН 0. При поступлении жаловалась на кашель, слабость и одышку при физической нагрузке. При объективном обследовании общее состояние удовлетворительное, в легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца - ритмичные, чистые. Пульс 80 в минуту, АД 130/80. Рентгенологическое обследование корни легких широкие, уплотнены за счет бронхопульмональных, паратрахеальных и трахеобронхиальных лимфоузлов. В обоих легких - тяжистые тени, в верхне-латеральных отделах - очаговоподобные уплотнения. Общий анализ крови гемоглобин - 115 г/л эритроциты - 3,8109 СОЭ - 11 мм. рт. ст. лейкоциты - 8,2106 сдвиг лейкоцитарной формулы влево, лимфопения. Биохимический анализ крови без патологии. В результате проведенного лечения самочувствие больной улучшилось, и при контрольном рентгенологическом обследовании через 23 дня было отмечено частичное рассасывание изменений в обоих легких. С целью прогнозирования дальнейшего течения саркоидоза у данной больной использован предлагаемый способ определения прогноза заболевания на основе исследования уровня фосфолипидов в индуцированной мокроте (общий липидный фосфор - 136,7 мкМ Р/л). Результат данного анализа свидетельствовал о благоприятном течении процесса. При дальнейшем динамическом наблюдении за больной в диспансере в течение 18 месяцев продолжала отмечаться положительная динамика процесса в виде рассасывания легочной диссеминации и размеров лимфоузлов. Рецидивов не отмечено. Таким образом, по сравнению с прототипом заявленный способ имеет следующие преимущества абсолютная неинвазивность и безопасность для пациента, так как не требует выполнения бронхоскопии. Способ может использоваться даже у тех пациентов, которым выполнение бронхоскопии по каким-либо причинам противопоказано (выраженная дыхательная недостаточность, тяжелые сопутствующие заболевания и т.д.), причем в силу необременительности для больного может повторяться многократно. Кроме того, данный способ отличают простота и дешевизна при сохранении высокой точности прогнозирования, так как для его выполнения необходим только ультразвуковой небулайзер. Для неблагоприятного течения саркоидоза характерен очень низкий уровень общего липидного фосфора (в интервале от 55,67 до 92,13 мкМ Р/л), а содержание ОФЛ в индуцированной мокроте в интервале от 95,76 до 180,44 мкМ Р/л свидетельствует о благоприятном прогнозе саркоидоза органов дыхания. Способ прогнозирования характера течения заболевания у больных саркоидозом органов дыхания может быть использован в практической работе всех медицинских учреждений, имеющих пульмонологические и фтизиатрические отделения. 9444 1 2007.06.30 Источники информации 1. А.с.1780002, П 501 33/50 // Бюл. 45. - 1992. 2. Котович И.Л. Особенности метаболической активности макрофагов и компоненты сурфактанта легких у больных саркоидозом Автореф. дисс. канд. мед. наук. 03.00.04. Гродно, 2001. - 21 с. (прототип). 3.,,.,.,.,., // Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6