Способ получения липосомальной формы противоопухолевого антибиотика адриамицина

логического больного фармакопейнь 1 м адриамицином. В результате включения адриамицина в липосомы существенно снижается кардиотоксичность препарата 1, что обеспечивает его реабилитацию и, следовательно, возможность более широкого применения для химиотерапии различных типов рака, сарком и лейкемий в тех случаях, когда возникают ограничения для применения препарата вследствие развитой кардиотоксичности и других токсических побочных эффектов.Известен способ получения липосомальной формы адриамицина путем приготовления липосом, обладающим трансмембраннь 1 м градиентом рН, с последующим включением антибиотика в липосомы 2. Недостатком способа является его сложное техническое исполнение. Для реализации этого способа требуется осуществить многократное замораживание-оттаивание липидной дисперсии в цитратном буфере (5-7 раз), при этом производится перемешивание перед каждой стадией замораживания, многократное продавливание дисперсии через поликарбонатнь 1 е фильтры (5-7 раз) и последующее перемешивание полученных таким образом липосом с антибиотиком в присутствии карбоната или бикарбоната натрия при 60 С.Известен также способ получения липосомальной формы противоопухолевого антибиотика путем эмульгирования липидов в водной среде, содержащей антибиотик и 1822 вес. глюкозы, под высоким давлением 3. Недостаток способа состоит в применении специального оборудования для создания давления свыше 50 атм, низкое соотношение антибиотик фосфолипиды 1 ( 17-20) в получаемом таким способом препарате.Другим известным способом, наиболее близким к заявляемому, является способ получения липосомальной формы адриамицина путем инкапсулирования антибиотика в липосомы, содержащие отрицательно заряженный фосфолипид-кардиолипин 4. Раствор адриамицина в метаноле смешивают с раствором кардиолипина в этаноле, полученный раствор упаривают насухо, к остатку добавляют раствор липидов, содержащий фосфатидилхолин, холестерин и стеариламин. Тонкую липидную пленку, содержащую кардиолипин и липиды, получают путем интенсивного встряхивания и высушивания раствора в токе азота. Высушенную пленку диспергируют в физиологическом растворе и вь 1 держивают 30 мин, затем содержимое колбы перемешивают на магнитной мешалке 10 мин. Полученные мультиламеллярные липосомы обрабатывают ультразвуком в ультразвуковой бане 90 мин при 37 С. После окончания обработки неинкапсулированный адриамицин отделяют от липосомального кардиолипинового комплекса диализом против физиологического раствора 30 час при 4 С. Недостатком способа является иммуногенность фосфолипида и большая вероятность разрушения липосом на его основе после их введения в кровяное русло антикардиолипиновыми антителами, уровень которых существенно повышается у онкологических больных 5. Степень инкапсулирования адриамицина в липосомы при реализации способа составляет 55 .Задачей настоящего изобретения является создание способа получения липосомальной формы адриамицина, обеспечивающего высокую степень инкапсулирования адриамицина в липосомы, снижение общей токсичности и кардиотоксичности антибиотика с сохранением терапевтических свойств при использовании полученной по заявляемому способу липосомальной формы адриамицина в качестве противоопухолевого средства.Поставленная задача решается заявляемым способом, включающим высушивание в вакууме смеси липидов, состоящей из 40-70 мас. дистеароилфосфатидилэтанола и 3060 мас. дистеароилфосфатидилхолина, ее диспергирование в водной среде, содержащей антибиотик и 10 мг/мл лактозы или маннита, при массовом соотношении антибиотика и смеси липидов 1,07,7 и обработку полученной дисперсии ультразвуком при частоте 22 кГц и мощности 0,5 Вт двукратно по 30 с при 60 С.1. Степень инкапсулирования адриамицина в липосомы достигает 91-93 .2. Снижение общей токсичности и кардиотоксичности при полном сохранении эффективности антибиотика.3. Фосфатидилэтанол в отличие от кардиолипина в составе липосом не является иммуногеннь 1 м соединением 6.Сущность изобретения подтверждается примером.В круглодонную колбу, содержащую пленку фосфолипидов, образовавшуюся после упаривания растворителя из раствора 20 мг смеси дистеароилфосфатидилэтанола (4070 ) и дистеароилфосфатидилхолина (60-30 ) в хлороформе на роторном испарителе,добавляют 2 мг адриамицина в 1 мл раствора лактозы или маннита (10 мг/мл), смесь интенсивно встряхивают до полного диспергирования фосфолипидов. Затем дисперсию обрабатывают ультразвуком (мощность 0,5 Вт, частота 22 кГц) на дезинтеграторе УЗДН-1 два раза по 30 с. Диспергирование и обработку ультразвуком проводят при 60 С.Эффективность инкапсулирования адриамицина в липосомы, содержащие дистеароилфосфатидилэтанол, иллюстрируется зависимостями, приведенными на с. 4-5. Оценка противоопухолевой эффективности токсичности липосомального адриамицина в сравнении с эталонным препаратом проведена по стандартным общепринятым методикам на аутбреднь 1 х мышах 1 СК в соответствии с методическими требованиями по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ 7. Содержание адриамицина в сердечной мышце определяли по методу 8. Результаты экспериментов обработаны статистически, оценены параметрическим методом по Стьюденту и представлены в табл. 1-3.Спектрофотометрический анализ степени встраивания антибиотика в липосомы осуществляли после отделения липосом от невстроенного антибиотика с помощью гельпроникающей хроматографии на микроколонках, заполненных Акрилексом Р 60. Приготовление микроколонок проводили следующим образом. Акрилекс Р 60 оставляли набухать в физиологическом растворе или растворе лактозы в течение 24 ч. Затем заполняли колонки набухшим сорбентом (гелем) и центрифугировали в течение 9 мин при 1000 об/мин с целью удаления избыточного объема раствора. Липосомы наносили на поверхность геля, колонки помещали в центрифужнь 1 е стаканы и центрифугировали в течение 30 мин при 1000 об/мин. Затем добавили равный объем физиологического раствора или раствора лактозы и снова центрифугировали при 1500 об/мин в течение 1 мин. При этом липосомы количественно элюируются из колонки, тогда как свободный адриамицин прочно задерживается в геле.Для того чтобы измерить количество инкапсулированного адриамицина, к липосомам добавляли аликвоту 10 -ного раствора тритона Х-100 и определяли оптическую плотность полученного раствора при 495 нм. Концентрацию антибиотика рассчитывали, используя коэффициент экстинкции 8 11800 М 1-см 1.Изобретение иллюстрируется следующими зависимостями.Оптимальное соотношение липидных компонентов для приготовления липосом получено из зависимости степени инкапсулирования адриамицина в липосомы от содержания в липидной смеси дистеароилфосфатидилэтанола. Для получения такой зависимости использовали композицию с постоянной суммарной концентрацией липидов при повь 1 шении доли дистеароилфосфатидилэтанола в каждом последующем опыте на 10 . Весовое соотношение адриамицин/липид во всех опытах было постоянным и составляло 110. Спектрофотометрический анализ степени инкапсулирования антибиотика в липосомы осуществляли после отделения липосом от свободного антибиотика с помощью гельпроникающей хроматографии на микроколонках с Акрилексом Р 60, как описано выше. Результаты опытов показали, что только 6 адриамицина инкапсулируется в липосомы,сформированные из одного дистеароилфосфатидилхолина. Включение в состав липидной композиции дистеароилфосфатидилэтанола приводит к увеличению доли встроенного влипосомы антибиотика и достигает Максимальных значений (91-93 ) при использовании смеси дистеароилфосфатидилэтанола (40-70 ) и дистеароилфосфатидилхолина (6030 ). Таким образом, по степени инкапсулирования адриамицина в липосомы заявляемый способ существенно превосходит аналог (55 ).Оптимальное соотношение липид/адриамицин получено из зависимости степени инкапсулирования адриамицина в липосомы, состоящие из смеси дистеароилфосфатидилэтанола (40 ) и дистеароилфосфатидилхолина (60 ) от количества добавленного антибиотика. При приготовлении липосом к 1 мг смеси липидов добавляли адриамицин,начиная от 50 мкг и увеличивая его количество в каждом последующем опыте на 20 мкг. Спектрофотометрический анализ степени инкапсулирования антибиотика в липосомы осуществляли после отделения липосом от свободного антибиотика с помощью гельпроникающей хроматографии на микроколонках с Акрилексом Р 60, как описано выше.Результаты опытов показали, что липосомы из 1 мг смеси дистеароилфосфатидилэтанола (40 ) и дистеароилфосфатидилхолина (60 ) способны включать от 50 до 130 мкг антибиотика (соотношение антибиотик/липид в крайней точке 1,0 7,7) практически количественно. Дальнейшее увеличение количества добавленного адриамицина сопровождается уменьшением степени инкапсулирования, и существенная доля лекарственного соединения остается в несвязанном липосомами состоянии. Добавление 210 мкг антибиотика приводит к его инкапсулированию в количестве 175 мкг (соотношение антибиотик/липид 1,0 5,7), при этом 35 мкг адриамицина остается в свободном состоянии.Таблица 1 Результаты испытания противоопухолевой эффективности адриамицина,инкапсулированного в липосомы заявляемым способом, на модели солидной карциномы Эрлиха у аутбредных мышей 1 СК.Разовая доза Показатели торможения роста опухоли после окон(мг/кг в/в), интервал чания лечения Группа животНЫХ Препарат МВЖДУ ВВСДВНИЯМИ через 1 сут. через 7 сут. в часах число вве- Средний объем ТРО, Средний объем ДЗНИЙ опухоли опухоли Контроль не- р-р 1 ТаС 10,9 67,2 1 3,8 115,4 1 8,59 леченныйПредставленные в табл. 1 результаты экспериментальной оценки противоопухолевой эффективности адриамицина, инкапсулированного в липосомы заявляемым способом, свидетельствуют о том, что липосомальный адриамицин, введенный по стандартной схеме мышам с имплантированной карциномой Эрлиха также эффективно тормозит рост солидной опухоли в течение 7 суток после окончания лечения (на 53-63 , р 0,001), как и свободный стандартный адриамицин. Видно также, что липосомы-плацебо в данных условиях эксперимента заметного торможения роста опухоли не вызывают. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что инкапсулирование противоопухолевого антибиотика адриамицина в липосомы заявляемым способом обеспечивает полное сохранение эффективности антибиотика, что соответствует методическим требованиям, предъявляемым к разработке новой лекарственной формы известного противоопухолевого препарата 7.Представленные в табл. 2 результаты оценки кардиотоксичности адриамицина, инкапсулированного в липосомы заявляемым способом, показывают, что спустя 15 мин после внутривенного введения липосомальной формы препарата кумуляция свободного антибиотика в сердечной мышце на 57 меньше, чем в случае введения фармакопейной лекформы адриамицина в той же дозе.Таблица 2 Результаты оценки кардиотоксичности адриамицина, инкапсулированного в липосомы заявляемым способом, после введения препарата (4 мг/кг, внутривенно) аутбредным мышам ТСК в сравнении с такой же дозой фармакопейного адриамицина.Группа живот- Флуоресцентный эквивалент содержания адриамицина (х 1 5,) в мионых, лекформа карде после однократного введения лекарственной формы спустя 15 мин 30 мин 60 мин 120 мин 180 мин Адриамицин в 5,6 1 1,6 7,0 1 1,4 7,6 1 1,1 7,2 1 0,6 6,4 1 0,5 липосомах Адриамицин сво- 13,0 1 1,3 10,8 1 0,9 10,7 1 0,6 11,7 1 0,5 8,7 1 0,6 бодный Эффект в , р 57 0,02 35 0,05 29 0,05 38 0,002 26 0,05В дальнейшем во все временные интервалы вплоть до 180 минут после инъекции данные измерения флуоресценции свидетельствуют о достоверно более низком уровне накопления адриамицина в миокарде. Представленные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый способ получения липосомального адриамицина обеспечивает снижение накопления антибиотика в сердечной мышце в 2,3-1,5 раза, что ведет к пропорциональному снижению его кардиотоксичности и, следовательно, к расширению показаний к применению адриамицина в липосомальной форме.Таблица 3 Результаты оценки общетоксического действия адриамицина, инкапсулированого в липосомы заявляемым способом, после введения в дозе 4 мг/кг внутривенно трехкратно через 48 ч аутбредным мышам ТСК с имплантированной опухолью Эрлиха (х 1 Эх).Динамика ранней гибели Ранняя Средняя Продолжи Группа ЖИВОЪ Количество мышеи - опухоленосителеи смертность тельность ЖИЗНИ НЫХ мышеи в (число погибших живот- животных Погибших Мышей группе ных в группе в течение) (14 сут.), (сут ) 3 сут. 6 сут. 10 сут. 14 сут. к контролюПредставленные В табл. 3 результаты испытания ОбЩЕТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ адриамицина, инкапсулированного В ЛИПОСОМЫ заявляемым СПОСОбОМ, СВИДЕТЕЛЬСТВУЪОТ О ТОМ,ЧТО ТОКСИЧНОСТЬ КУРСОВОЙ ДОЗЫМГ/КГ, ВНуТрИВЕННО) липосомального адриамицина у МЫШЕЙ С имплантированной ОПуХОЛЬЮ Эрлиха СУ 1 ЦЕСТВЕННО МЕНЬШЕ, ЧЕМ СВОбОДНОГО антибиотика. Результаты ЭКСПЕРИМЕНТОВ показали, ЧТО ТОКСИЧНОСТЬ адриамицина В ЛИПОСОмах ПО динамике И ПрОЦЕНТу ГИбЕЛИ МЫШЕЙ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ В 2 раза НИЖЕ, ЧЕМ ТОКСИЧНОСТЬ препарата-стандарта.