Способ получения липосомального рифампицина

(71) Заявитель Республиканское унитарное производственное предприятие Белмедпрепараты(72) Авторы Никольская Валентина Петровна Мартынова Мария Алексеевна Гуревич Геннадий Львович Петров Петр Тимофеевич Скрипко Анна Дмитриевна Матус Виль Константинович Конев Сергей Васильевич(73) Патентообладатель Республиканское унитарное производственное предприятие Белмедпрепараты(56)19990770, 2001. Матус В.К. и др. // Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус. Серыя бялагчных навук. - 2000. -1. - С. 131-141. Грязнова Н.С. и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37,7. - С. 3-7.... - 1981. - . 640. - . 252-262.5019394, 1991.93/23016 1.94016341 1, 1996. Березовская Л.Н. и др. // Антибиотики и химиотерапия, 1990. - Т. 35,10. С. 31-35.(57) Способ получения липосомального рифампицина, включающий формирование сухой липидной пленки из фосфатидилхолина, холестерина, стеариновой кислоты, взятых в мольном соотношении 100,50,2, рифампицина и антиоксиданта -токоферола, взятого из расчета 0,02-0,04 мг на 1 мг суммарных липидов, отличающийся тем, что пленку растворяют в 0,1 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,1 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, 24 мг/мл холевокислого натрия, 1,35 мг/мл низкомолекулярного поливинилпирролидона и 0,068 мг/мл сульфита натрия, и инкубируют при 4-6 С в течение 10-15 часов до образования стойкого мицеллярного раствора, который подвергают диализу через целлюлозную мембрану с нормированными порами для веществ с молекулярной массой 10000 кД против 0,1 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,4, содержащего 0,1 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, при соотношении 1400 с 3-4-кратной сменой буфера в течение 72 часов. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения липосомальной формы антибиотика рифампицина, которая может быть использована в медицине при лечении различных инфекционных заболеваний. Рифампицин - полусинтетический антибиотик широкого спектра действия из группы рифамицинов. Высокоактивен в отношении грамположительных бактерий и микобактерий 7525 1 2005.12.30 туберкулеза, является противотуберкулезным препаратом 1-го ряда. В больших концентрациях активен в отношении грамотрицательных бактерий. Оказывает бактериостатическое, а в высоких концентрациях - бактерицидное действие. При длительном применении гепатотоксичен. Токсический эффект рифампицина снижается при включении в липосомы 1. Известен способ инкапсулирования рифампицина в фосфолипидные липосомы, основанный на ультразвуковом диспергировании при 37 С в течение 10 мин в фосфатном буфере сухой липидной пленки, состоящей из яичного фосфатидилхолина, холестерина и дицетилфосфата в молярном соотношении 712, содержащей рифампицин. Эффективность включения рифампицина в липосомы составляет 14-17 исходного количества. Полученные липосомы являются мультиламеллярными, размер основного пула везикул варьирует от 3,0 до 3,3 мкм в диаметре 2. Однако данный способ имеет ряд недостатков. Образующаяся липосомальная форма рифампицина обладает относительно высокой токсичностью за счет синтетического дицетилфосфата, используемого в качестве заряженного липосомообразующего компонента. Кроме того, она является недостаточно стабильным препаратом при хранении в течение 3-х недель утечка антибиотика достигает 30 , а через 6 месяцев липосомы разрушаются вследствие модифицирующего воздействия озвучивания на молекулы фосфолипида и отсутствия антиоксидантов. К тому же получаемая липосомальная форма антибиотика из-за большого диаметра образующихся везикул не может быть подвергнута стерилизующей фильтрации - единственному способу стерилизации липосомального препарата. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения липосомального рифампицина, основанный на высокоскоростном механическом диспергировании в 0,1-фосфатном буфере, содержащем 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 7,4 сухой липидной пленки, состоящей из яичного фосфатидилхолина, холестерина и стеариновой кислоты в молярном соотношении 10 0,5 0,2 при концентрации суммарных липидов от 20 до 75 мг/мл суспензии, содержащей рифампицин и токоферол в качестве антиоксиданта, при этом размер получаемых везикул достигает 5 мкм 3 (прототип). Цель изобретения - получение высокоэффективного липосомального препарата на основе рифампицина, обеспечение стерильности липосомального рифампицина и увеличение стабильности лекарственной формы. Указанная задача решается путем использования для формирования липосом метода,основанного на удалении детергента из смеси буфера, липосомообразующих компонентов и детергента с помощью диализа, а полученный препарат подвергают лиофильной сушке. Существенные отличия заявляемого способа от прототипа заключаются в следующем. Для образования липосом используют детергентный диализ вместо механического диспергирования. Преимущество детергентного диализа заключается прежде всего в том,что образующиеся липосомы имеют моноламмелярную структуру и относительно гомогенны по размерам с диаметром везикул от 30 до 180 нм. Такие липосомы успешно стерилизуются мембранной фильтрацией на фильтрах с диаметром пор 0,22 мкм, что обеспечивает их стабильность и лечебную эффективность. Для дополнительного повышения стабильности липосомального рифампицина его лиофильно высушивают, а перед использованием проводят регидратацию. Совокупность отличительных признаков предлагаемого изобретения обуславливает положительные эффекты обеспечение стерилизации липосомального препарата, повышение стабильности, и для достижения поставленной цели получения липосомальной формы рифампицина используется впервые. Сущность предлагаемого способа и граничные значения, указанные в формуле заявки,иллюстрируются следующими конкретными примерами. 2 7525 1 2005.12.30 Пример 1 Способ осуществляют следующим образом. Компоненты липосомообразующей смеси - 262,50 мг яичного фосфатидилхолина,6,11 мг холестерина и 1,53 мг стеариновой кислоты, 5,4 мг -токоферола из расчета 0,02 мг/мг суммарных липидов и 15 мг рифампицина растворяют в 10 мл хлороформа в круглодонной колбе и выпаривают на роторном испарителе при температуре 35-40 С до образования мономолекулярной пленки. Затем в колбу добавляют 10 мл 0,1 натрийфосфатного буфера, содержащего 0,1 мМ динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, вносят 240 мг натрия холевокислого, 13,5 мг низкомолекулярного поливинилпирролидона, 0,68 мг натрия сульфита, полученную смесь встряхивают на высокоскоростном миксере до полного растворения липидной пленки и инкубируют при температуре 4-6 С в течение 10-15 часов до образования стойкого мицеллярного раствора рифампицина. Затем мицеллярный раствор рифампицина подвергают диализу через целлюлозную мембрану с нормированными порами для веществ с молекулярной массой 10000 кД против 0,1 натрий-фосфатного буфера, содержащего 0,1 мМ динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, в соотношении 1400 с трех-, четырехкратной сменой в течение 72 часов. Для оценки степени встраивания антибиотика в липосомы свободный и липосомальный рифампицин разделяют путем гель-фильтрации на колонках с сефадексом-50 и определяют их количества по результатам спектрофотометрических измерений в двухволновом режиме (475/520). Суспензию липосом подвергают лиофильной сушке и используют для оценки физических параметров, накопления продуктов перекисного окисления липидов и стабильности липосомального рифампицина при хранении. Эффективность включения рифампицина, рассчитанная по результатам спектрофотометрии, составляет 22,8 . В процессе хранения липосомального препарата в течение 6 месяцев выход рифампицина из липосом составляет 6,0 . Липосомы имели моноламеллярное строение с диаметром 35-100 нм и практически не изменялись в процессе хранения. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в процессе хранения увеличивалось в образцах на 13,0 . Пример 2 Компоненты липосомообразующей смеси - 262,50 мг яичного фосфатидилхолина,6,11 мг холестерина и 1,80 мг стеариновой кислоты, 10,8 мг -токоферола из расчета 0,04 мг/мг суммарных липидов и 15 мг рифампицина растворяют в 10 мл хлороформа в круглодонной колбе и выпаривают на роторном испарителе при температуре 35-40 С до образования мономолекулярной пленки. Затем в колбу добавляют 10 мл 0,1 натрийфосфатного буфера, содержащего 0,1 мМ динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, вносят 240 мг натрия холевокислого, 13,5 мг низкомолекулярного поливинилпирролидона, 0,68 мг натрия сульфита. Способ осуществляют аналогично примеру 1. Эффективность включения рифампицина, рассчитанная по результатам спектрофотометрии, составляет 24,2 . Исследование стабильности липосомального препарата после шести месяцев хранения показало, что выход рифампицина составил 4,00 от исходного уровня. Липосомы имели моноламеллярное строение с диаметром 35-100 нм и практически не изменялись в процессе хранения. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в процессе хранения по отношению к начальному уровню не превышало 9,0 . 7525 1 2005.12.30 Источники информации 1. Курунов Ю.Н., Николин В.П. , Каледин В.И. и др. Изучение эффективности антибактериальных препаратов, заключенных в липосомы, при лечении экспериментального туберкулеза // Проблемы туберкулеза. - 1982. -10. - С. 54-58. 2..,//. - 1989. - . 33,4. - . 429-433. 3. Заявка 19990770, 2001. Способ получения липосомальной формы рифампицина. Матус В.К., Церенков В.М., Гуревич Г.Л., Мартынова М.А., Никольская В.П., Конев С.В. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.