Аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скота Bovine сoronavirus КМИЭВ – V112- штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ КОРОНАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТАС КМИЭВ - 112 - ШТАММ-АНТИГЕН(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Красочко Ирина Александровна Ломако Юрий Васильевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2268937 1, 2006. ГОЛОВКО А.Н. и др. Ученые записки Витебской государственной академии ветеринарной медицины. - Т. 34. - Витебск, 1998. - С.118-120.10697 1, 2008.2145236 1, 2000.(57) Аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скотас КМИЭВ - 122 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, а также к биотехнологии и может быть использовано при конструировании биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения коронавирусной инфекции крупного рогатого скота. Коронавирусная инфекция крупного рогатого скота - контагиозная остропротекающая болезнь новорожденных телят, характеризующаяся поражением желудочно-кишечного и респираторного тракта проявляется профузным поносом, иногда со слизью и кровью в каловых массах, дегидратацией организма, депрессией и истощением. Болезнь широко распространена во многих странах мира 1. В настоящее время известен ряд штаммов коронавируса крупного рогатого скота, используемых для изготовления вакцинных и диагностических биопрепаратов. Известен аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скота ВГНКИ 8 для изготовления вакцинных препаратов. Известный штамм культивируют на перевиваемой культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), в качестве ростовой питательной среды используют 0,5 -ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса (ГЛАХ), а в качестве поддерживающей - 0,5 -ный ГЛАХ и 1,5 -ной сыворотки крови северных оленей. Инфекционный титр известного штамма составляет 4,5-6,0 ТЦД 50/мл 2. Инфекционный титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Недостатком известного штамма является то, что процесс приготовления клеточного сырья для культивирования известного штамма характеризуется трудоемкостью и неста 18413 1 2014.08.30 бильностью за счет трипсинизации ткани животных и сезонности получения этой ткани. Кроме того, для культивирования известного штамма используются дорогостоящие питательные среды сложного состава. Известен штамм коронавируса крупного рогатого скота ГКВ 2338 для изготовления вакцинных и диагностических препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН под регистрационным номером депонента ГКВ 2338. Известный штамм размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и культуре клеток , в которых накапливается в титре 6,5-7,5 ТЦД 50/см 3 3. Известен штамм коронавируса крупного рогатого скота ВНИИЗЖ-ДЕП для изготовления вакцинных и диагностических препаратов, депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ. Известный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки теленка (, Таурус), коронарных сосудов теленка (КСТ) и в гетерологичной культуре клеток обезьяни в течение 3-4 суток инкубирования при 37 С накапливается в количестве до 108 частиц/см 3 (данные электронной микроскопии). Обладает способностью репродуцироваться с такой же степенью накопления в культуре клетокпри 34 С 4. Общим недостатком известных штаммов является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на их основе вакцинных препаратов, обусловленная тем, что известные штаммы не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов коронавируса крупного рогатого скота, циркулирующих в хозяйствах Республики Беларусь. За прототип взят штамм коронавируса крупного рогатого скота ВС-1 для изготовления вакцинных и диагностических препаратов против коронавирусной инфекции, депонированный в Депозитарии государственного научно-контрольного института биотехнологии и штаммов микроорганизмов Украины под номером 232. Штамм коронавируса крупного рогатого скота ВС-1 характеризуется следующими признаками и свойствами. Назначение. Штамм коронавируса крупного рогатого скота ВС-1 используется для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Культурально-морфологические свойства. РНК-содержащий вирус, размеры вирионов от 770 до 100 нм, полиморфные, имеют липидную оболочку, нуклеокапсид спиральный,диаметр 9-10 нм, на поверхности имеет ворсинки длиной 24 нм. Чувствителен к эфиру,хлороформу, дезоксихолату, устойчив к трипсину и колебаниям среды с величинойот 5,0 до 7,0. Культивируется в первичных и перевиваемых культурах клеток трахеи теленка, легкого эмбриона коровы, коронарных сосудов теленка в присутствии трипсина. ЦПД проявляется через 3-4 суток. Инфекционный титр вируса - 5,0-5,5 ТЦД 50/мл. Антигенная активность. Вирус вызывает выработку вируснейтрализующих антител у телят и кроликов при парентеральном введении. Патогенные свойства. Патогенен для телят, контагиозный, механизм передачи - контактный и алиментарный. Биологические свойства. Стабильные. Серологические свойства. Вирус проявляет агглютинирующую и адсорбирующую активность в отношении эритроцитов хомяка, петуха и белых мышей. Антигенные свойства. В организме телят способствует выработке вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и гемагглютинирующих антител. Иммуногенные свойства. Парентеральное введение вируса способствует выработке вируснейтрализующих антител, что обеспечивает защиту животных при экспериментальном заражении. Биохимические свойства. Стандартные для первичных и перевиваемых клеточных культур. 2 18413 1 2014.08.30 Основные условия хранения. Замораживание при температуре 40 С, лиофилизация. Стабильность основных признаков штамма при длительном хранении. Штамм сохраняет свои особенности и признаки при выращивании на питательной среде - 5 -ном гидролизате. Поддержание штамма. Проводят методом репродукции вируса на чувствительных культурах клеток 5. Недостатком известного штамма-прототипа является то, что он не аттенуирован и обладает выраженной патогенностью для телят, что исключает возможность его использования для конструирования живых вирусных вакцин, кроме того, использование вирулентного штамма в технологическом процессе при изготовлении инактивированной вакцины сопряжено с потенциальной опасностью в ветеринарно-санитарном отношении. Также известный штамм-прототип обладает антигенными и иммунобиологическими отличиями в сравнении с циркулирующими в животноводческих хозяйствах Республики Беларусь эпизоотическими штаммами возбудителей, поэтому вакцинные препараты, изготовленные на основе известного штамма-прототипа, будут характеризоваться более низкой профилактической эффективностью. В связи с этим актуальной остается проблема поиска нового высокоиммуногенного аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скота, имеющего схожую антигенную структуру с циркулирующими на территории Республики Беларусь эпизоотическими штаммами, для производства эффективных средств диагностики, специфической профилактики и лечения коронавирусной инфекции крупного рогатого скота. Задачей настоящего изобретения стало получение нового производственного аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скота, обладающего высокой биологической, антигенной, иммуногенной активностью и высокой доминантностью над эпизоотическими штаммами. Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм коронавируса крупного рогатого скота- штамм-антиген - на первичной культуре клеток почки эмбриона коровы ПЭК от теленка 10-дневного возраста, павшего с клиническими признаками коронавирусной инфекции, и аттенуирован путем длительного культивирования на первичной культуре клеток ПЭК и перевиваемых культурах клеток ПТ и . Аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скота штамм-антиген депонирован в коллекции РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского и ему присвоен регистрационный номер КМИЭВ - 122. Характеристика аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена. Таксономическая принадлежность. РНК-геномный вирус, входящий в семейство , род , вид. Культурально-морфологические свойства РНК-содержащий вирус, вирионы диаметром 100-120 нм. Имеет плавучую плотность 1,18-1,21 г/мл в градиенте сахарозы и 1,24 г/мл в градиенте хлористого цезия на его поверхности имеются булавовидные (или в виде лепестков подсолнуха) выросты (ворсинки) длиной от 12 до 23 нм, образующие подобие короны содержит положительно заряженную, одноцепочечную, несегментированную полиаденилированную РНК имеют липидную оболочку. В состав коронавируса крупного рогатого скота входит три крупных гликопротеида массой 100, 120 и 140 кД и один легкий с молекулярной массой 26 кД, которые составляют наружную часть вириона (пепломера), а протеин массой 52 кД - внутреннюю, непосредственно прилегающую к вирусной РНК. Полипептиды с молекулярной массой в 38 и 22 кД формируют нуклеокапсиды вируса. Установлена его способность вызывать агглютинацию эритроцитов мыши, крысы, хомяка и ее отсутствие по отношению к эритроцитам других видов животных и О-группы крови человека. 3 18413 1 2014.08.30 При культивировании на культурах клеток цитопатическое действие (ЦПД) наступает через 3-4 суток после инокуляции и характеризуется образованием синтиция и симпластов. Среднее значение титра инфекционной активности в культурах клеток составляет 5,05,5 ТЦД 50/мл. Физико-химические свойства. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, колебаниям среды с величинойот 3,0 до 9,0. Наиболее устойчив при 6,7-7,5. Вирус не чувствителен к антибиотикам. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Биотехнологическая характеристика. Вирус размножается в перевиваемых культурах клетоки ПТ, первичной культуре клеток ПЭК со средним значением титра инфекционной активности вируса - 5,0-5,5 ТЦД 50/мл при соблюдении следующих параметров множественность заражения 0,01-1,0 ТЦД 50/кл, питательная среда среда Игла и среда 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Время культивирования 3-4 суток. Установленный температурный режим - 37 С, при 6,7-7,5. Стабильность. Штамм сохраняет свои свойства при выращивании на питательной среде Игла и среде 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Антигенная активность. Уровень специфических антител к аттенуированному штамму коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штаммуантигену в сыворотках крови коров в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) составляет 164. Иммуногенность. При вакцинации коров, кроликов и белых мышей инактивированной вакциной, сконструированной на основе аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена - титр вируснейтрализующих антител составляет в среднем 6,00 2 (в РНГА), 5,20,2 2 и 4,20,2 2 (в реакции нейтрализации ( соответственно. Безвредность. Аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамм-антиген не патогенен для телят и лабораторных животных. Сведения о криоконсервации. Аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамм-антиген - хранится в замороженном состоянии при температуре 20 С и ниже или в лиофилизированном виде - при 24 С. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами аттенуированный штамм не патогенен для телят и лабораторных животных по сравнению с прототипом. Прототип является неаттенуированным (не ослаблен), контагиозным, патогенным для телят, с контактным и алиментарным механизмами передачи, вызывая при введении чувствительным животным клинические признаки коронавирусной инфекции. Кроме того, заявляемый штамм выделен на территории Республики Беларусь и имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, что позволяет нам достичь поставленной задачи. Пример 1. Выделение штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена. Материалом для выделения штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена - послужил участок пораженного кишечника от теленка возрастом 10 дней, павшего с клиническими признаками коронавирусной инфекции. Выделение штамма осуществлено на первичной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) путем 3-х слепых пассажей и идентификацией после получения характер 4 18413 1 2014.08.30 ного для вируса ЦПД со специфической гипериммунной сывороткой в реакции нейтрализации (РН). Пример 2. Аттенуация штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена. Для снижения патогенности и сохранения антигенности проведено пассирование вируса на культуре клеток по следующей схеме 5 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК 10 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток . Пример 3. Культивирование аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена. Выращивают перевиваемую культуру клетокв течение 2-3-х суток при температуре 37 С в термостате на питательной среде, состоящей в объеме 45-47 из среды Игла, и 45-47- среды 199 и 6-10 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота,которую заражают аттенуированным штаммом коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штаммом-антигеном - с инфекционным титром 5,0-5,5 ТЦД 50/мл, в который перед заражением вносят трипсин в количестве 15-18 мкг/см 3, причем коронавирус крупного рогатого скота вносят в культуру клетокв дозе 5-6 мл на матрас (10-20 вирусных единиц на клетку) или 4-5 мл на роллер и культивируют в течение 24-48 ч при температуре 37 С в термостате при 6,8-8,0 в поддерживающей среде, состоящей в объеме 48-49 из среды Игла, 48-49- среды 199 и 24- сыворотки крови крупного рогатого скота, в которую вносят трипсин в количестве 5-8 мкг/см 3, определяют микроскопическим визуальным методом наличие разрушения монослоя под действием аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена - в сравнении с контролем, затем матрасы или роллеры с полученным аттенуированным штаммом коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штаммом-антигеном - подвергают замораживанию при температуре 20 С на 24 ч, после чего их размораживают при температуре 37 С в термостате в течение 2-4 ч и титруют на культуре клеток . Инфекционный титр аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена - после титрации на культурах клеток по методу Рида и Менча составляет 5,0-5,5 ТЦД 50/см 3. Пример 4. Определение инфекционной активности аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена. Инфекционный титр аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена - определяют по методу Рида и Менча. Контроль инфекционной активности аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена - после проведения пассажей проводят на различных культурах клеток (табл. 1). Таблица 1 Инфекционная активность аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена ( ТЦД 50/мл) Культура клеток ПЭК ПТ (линия Таурус) 18413 1 2014.08.30 Пример 5. Определение иммуногенной (антигенной) активности аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена. Для контроля иммуногенной (антигенной) активности аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамм-антиген с инфекционным титром 5,0 ТЦД 50/мл после проведения пассажей на различных культурах клеток вводят кроликам по 5,0 см 3 внутримышечно двукратно с интервалом 14 дней. Наличие антител в сыворотке крови определяют через 14 суток после вторичной вакцинации в реакции нейтрализации (табл. 2). Таблица 2 Иммуногенная (антигенная) активность аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена после проведения пассажей на различных культурах клеток (2) Культура клеток ПЭК ПТ (линия Таурус) Проводят заражение 5 коров аттенуированным штаммом коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штаммом-антигеном, который получен путем длительного культивирования на различных культурах клеток на первом этапе - 10 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК, затем 15 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) и 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток . У животных, получавших адаптированный вирус, не должно быть отмечено повышения температуры тела, энтеритов, воспаления органов дыхания. У коров через 21 день после введения аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамма-антигена - должна отмечаться выработка противовирусных антител в титре не ниже 164 в РНГА. Таким образом, аттенуированный штамм коронавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 122 - штамм-антиген - выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, кроме того, заявляемый штамм не патогенен для телят и лабораторных животных по сравнению с прототипом и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. Источники информации 1. Красочко П.А. и др. Болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. П.А.Красочко. - Минск Бизнесофсет, 2005. - С. 54. 2. Патент 1748327, МПК 6 61 39/00, 61 39/215, 12 7/00, 1995. 3. Патент 2395299, МПК 6 61 39/295, 12 7/08, 61 31/12, 2010. 4. Патент 2268937, МПК 6 61 39/215, 12 7/00, 61 31/12, 2006. 5. Патент 67258, МПК 6 127/00, 61 39/215, 61 35/76, 12 1/70, 12 1/93, 2004 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6