Аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота Bovine herpesvirus-1 КМИЭВ – V123 – штамм- антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Красочко Ирина Александровна Ломако Юрий Васильевич Жук Вероника Петровна Бучукури Джемал Владимирович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)26677 , 2007.2323253 1, 2008.10697 1, 2008. СИДИБЕ ШАРЛЬ ЭМИЛЬ КАЛИЛУ. Влияние типа культуры клеток и штамма вируса на антигенную активность инактивированной ассоциированной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота Автореф. дис.М., 1995. - С. 1-17.(57) Аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, а также к биотехнологии и может быть использовано при конструировании биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ, пузырьковая сыпь) - остро протекающая контагиозная болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся катарально-некротическими поражениями дыхательных путей, лихорадкой, общим угнетением и конъюнктивитом, а также пустулезным вульвовагинитом 1. В настоящее время известен ряд штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, используемых для изготовления вакцинных и диагностических биопрепаратов. Известен производственный штамм вируса инфекционного ринотрахеита 1 Щапово с инфекционным титром 7,5-8,5 ТЦД 50/см 3 после концентрирования на полиэтиленгликоле-6000 (ПЭГ-6000), используемый для изготовления инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, который размножают в первично-трипсинизированных культурах клеток почки теленка (ПТ) или 18414 1 2014.08.30 тестикулов бычка (ТБ) или их субкультурах - перевиваемых клеточных линиях ,ЛЭК, ТР 2. Инфекционный титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Недостатком известного штамма является то, что он может быть использован для конструирования вакцинного препарата только после проведения трудоемкого процесса концентрирования вируссодержащего материала для получения необходимого количества антигена в прививочной дозе. Кроме того, известный штамм является полевым и не аттенуирован, что ограничивает его использование для конструирования живых вирусных вакцин. Известен штамм вируса инфекционного ринотрахеита ИРТ- (ИЕКВМ) для изготовления вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН. Известный штамм культивируют на перевиваемой культуре клеток трахеи теленка, выращенной на 0,5 -ном гемогидролизате лактальбумина на растворе Хенкса и среде 199 в соотношении 11, инфекционный титр - 5,05,5 ТЦД 50/мл 3. Недостатком известного штамма является его низкая биологическая активность, титр вируса достигает 5,0-5,5 ТЦД 50/мл, что является недостаточным для конструирования инактивированных вакцин. Известен штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота Молдавский для изготовления вакцинных и диагностических препаратов против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, депонированный в Депозитарии государственного научно-контрольного института биотехнологии и штаммов микроорганизмов Украины под номером 228. Известный штамм культивируют на перевиваемой культуре клеток почки теленка, легких эмбриона коровы, трахеи теленка, коронарных сосудов теленка, титр вируса составляет 7,0-7,5 ТЦД 50/мл, цитопатическое действие (ЦПД) выявляется через 24 ч 4. Недостатком известного штамма является то, что он не аттенуирован, обладает выраженной патогенностью для восприимчивых животных, заражение происходит алиментарным, аэрогенным, контактным и половым путем, что исключает возможность его использования для конструирования живых вирусных вакцин, кроме того, использование вирулентного штамма в технологическом процессе при изготовлении инактивированной вакцины сопряжено с потенциальной опасностью в ветеринарно-санитарном отношении. Известен штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ВНИИЗЖ-ДЕП для изготовления вакцинных и диагностических препаратов, депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ. Известный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток ВНК-21,и ЗКГ, вызывая цитопатическое действие в течение 48-96 ч инкубирования, накапливается в титре 6,5-8,0 ТЦД 50/см 3 5. Известен штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ТК-А,используемый для инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Известный штамм культивируют роллерным способом на перевиваемой культуре клеток . Биологическая активность известного штамма составляет 7,25-8,0 ТЦД 50/мл 6. Общим недостатком известных штаммов является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на их основе вакцинных препаратов, обусловленная тем, что известные штаммы не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, циркулирующих в хозяйствах Республики Беларусь. За прототип взят штаммвируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота КМИЭВ-6 для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. 2 18414 1 2014.08.30 ШтаммКМИЭВ-6 вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота характеризуется следующими признаками и свойствами. Назначение. ШтаммКМИЭВ-6 вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота используется для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Культурально-морфологические свойства. ДНК-содержащий вирус, вирионы диаметром 106-108 нм, чувствителен к эфиру, хлороформу, колебаниям среды с величинойот 3,0 до 9,0, на поверхности имеет выступы. Наиболее стойкий при 6,8-7,5. ЦПД наступает через 24-48 ч после инокуляции и характеризуется округлением клеток, зернистостью, разрушением монослоя. Антигенная активность. Вирус вызывает выработку вируснейтрализующих антител у телят и кроликов при парентеральном введении. Стабильность основных признаков штамма при длительном хранении. Штамм сохраняет свои признаки при выращивании на питательной среде, состоящей из гидролизата с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Безвредность. Не патогенен для телят и лабораторных животных. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Основные условия хранения. ШтаммКМИЭВ-6 вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в замороженном сотоянии при температуре 20 С и ниже или в лиофилизированном при температуре 4 С. Поддержание штамма. Проводят методом субкультивирования на перевиваемой линии , ПТ или первичной культуре клеток ПЭК. Для культивирования вируса используется питательная среда - 5 -ный гемогидролизат с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота 7. Недостатком данного штамма является то, что он характеризуется сравнительно невысокой биологической и антигенной активностью инфекционный титр данного штамма достигает 5,5-6,0 ТЦД 50/см 3, а антигенная активность через 21 день после его введения телятам составила в РНГА 164, следовательно вакцина, сконструированная с использованием данного штамма, будет отличаться более низкой профилактической и иммунологической эффективностью при проведении специфической профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. В связи с этим актуальной остается проблема поиска новых высокоиммуногенных аттенуированных штаммов вируса инфекционного ринотрахеита для производства эффективных средств диагностики, специфической профилактики и лечения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Задачей настоящего изобретения стало получение нового производственного аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, обладающего высокой биологической, антигенной, иммуногенной активностью и высокой доминантностью над эпизоотическими штаммами. Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 - штамм-антиген на первичной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) от теленка 3-месячного возраста, павшего с клиническими признаками инфекционного ринотрахеита, и аттенуирован путем длительного культивирования на первичной культуре клеток ПЭК и перевиваемых культурах клеток ПТ (линия Таурус) и . Аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 - штамм-антиген депонирован в коллекции РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского и ему присвоен регистрационный номер КМИЭВ - 123. 3 18414 1 2014.08.30 Характеристика аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген. Таксономическая принадлежность. ДНК-геномный вирус, входящий в семейство, род , вид-1. Культурально-морфологические свойства. Состоит из линейной 2-нитчатой ДНК с молекулярной массой 92-102 кД, вирионы - частицы округлой формы, состоят из 4-х структурных компонентов нуклеотида, капсида диаметром 120-150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой, мембраны и наружной оболочки. Плавучая плотность вирионов в градиенте 1,27-1,29 г/см 3. Нуклеотид окружен икосаэдрическим капсидом диаметром 100-110 нм, содержащим 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. При культивировании на культурах клеток ЦПД наступает в течение 24-48 ч инкубирования и характеризуется округлением клеток, зернистостью, отслоением монослоя, накапливается в титре 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3. Физико-химические свойства. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, колебаниям среды с величинойот 3,0 до 9,0. Наиболее устойчивый при 7,0-7,5. Вирус не чувствителен к антибиотикам. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Биотехнологическая характеристика. Вирус размножается в перевиваемых культурах клетоки ПТ, первичной культуре клеток ПЭК со средним значением титра инфекционной активности вируса - 6,5-7,0 ТЦД 50/мл при соблюдении следующих параметров множественность заражения 0,01-1,0 ТЦД 50/кл, питательная среда среда Игла и среда 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Время культивирования 24-48 ч. Установленный температурный режим - 37 С, при 7,0-7,5. Стабильность. Штамм сохраняет свои свойства при выращивании на питательной среде Игла и среде 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Антигенная активность. Уровень специфических антител к аттенуированному штамму вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген в сыворотках крови телят в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) составляет 1128. Иммуногенность. При вакцинации телят, кроликов и белых мышей инактивированной вакциной, сконструированной на основе аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штаммантиген титр вируснейтрализующих антител составляет в среднем 7,20,2 2 (в РНГА),6,20,2 2 и 4,50,5 2 (в реакции нейтрализации (РН соответственно. Безвредность. Аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВЛ 123 - штамм-антиген не патогенен для телят и лабораторных животных. Сведения о криоконсервации. Аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штаммантиген хранится в замороженном состоянии при температуре -20 С и ниже или в лиофилизированном виде - при 2 4 С. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм имеет более высокую биологическую и антигенную активность, по сравнению с прототипом. Так, инфекционный титр аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штаммантиген на культурах клеток достигает 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3, тогда как у прототипа - 5,5-6,0 ТЦД 50/см 3, антигенная активность заявляемого штамма через 21 день после его введения телятам составила 1128 в РНГА, тогда как в прототипе данный показатель был ниже и составил 164, что позволяет достичь поставленной задачи. 4 18414 1 2014.08.30 Пример 1. Выделение штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген. Материалом для выделения штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген послужили участки пораженных легких от теленка возрастом 3 месяца, павшего с клиническими признаками инфекционного ринотрахеита. Выделение штамма осуществлено на первичной культуре клеток ПЭК путем 3-х слепых пассажей и идентификацией после получения характерного для вируса ЦПД со специфической гипериммунной сывороткой в РН. Пример 2. Аттенуация штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген. Для снижения патогенности и сохранения антигенности проведено пассирование вируса на культуре клеток по следующей схеме 5 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК 10 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток . Пример 3. Культивирование аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген. Выращивают перевиваемую культуру клетокв течение 2-3-х суток при температуре 37 С в термостате на питательной среде, состоящей вобъеме 45-47 из среды Игла, 45-47- среды 199 и 6-10- сыворотки крови крупного рогатого скота, которую заражают аттенуированным штаммом вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген с инфекционным титром 6,5-7,0 ТЦД 50/мл в дозе 5-6 мл на матрас (10-20 вирусных единиц на клетку) или 4-5 мл на роллер и культивируют в течение 24-48 ч при температуре 37 С в термостате при 6,8-8,0 в поддерживающей среде, состоящей в объеме 48-49 из среды Игла,48-49- среды 199 и 2-4- сыворотки крови крупного рогатого скота, определяют микроскопическим визуальным методом наличие разрушения монослоя под действием аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген в сравнении с контролем, затем матрасы или роллеры с полученным аттенуированным штаммом вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штаммантиген подвергают замораживанию при температуре 20 С на 24 ч, после чего их размораживают при температуре 37 С в термостате в течение 2-4 ч и титруют на культуре клеток . Инфекционный титр аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штаммантиген после титрации на культуре клетокпо методу Рида и Менча составляет 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3. Пример 4. Определение инфекционной активности аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 штамм-антиген. Инфекционный титр аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген определяют по методу Рида и Менча. Контроль инфекционной активности аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген после проведения пассажей проводят на различных культурах клеток (табл. 1). 5 18414 1 2014.08.30 Таблица 1 Инфекционная активность аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген ( ТЦД 50/мл) Культура клеток ПЭК ПТ (линия Таурус) Пример 4. Определение иммуногенной (антигенной) активности аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 ИЭ - 123 - штамм-антиген. Для контроля иммуногенной (антигенной) активности аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ 123 - штамм-антиген с инфекционным титром 6,5 ТЦД 50/мл после проведения пассажей на различных культурах клеток вводят кроликам по 5,0 см 3 внутримышечно двукратно с интервалом 14 дней. Наличие антител в сыворотке крови определяют через 14 суток после вторичной вакцинации в реакции нейтрализации (табл. 2). Таблица 2 Иммуногенная (антигенная) активность аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген после проведения пассажей на различных культурах клеток (2) Культура клеток ПЭК ПТ (линия Таурус) Проводят заражение 5 телят аттенуированным штаммом вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген,который получен путем длительного культивирования на различных культурах клеток на первом этапе - 10 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК, затем 15 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) и 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток . У животных, получавших адаптированный вирус, не должно быть отмечено повышения температуры тела, энтеритов, воспаления органов дыхания. У телят через 21 день после введения аттенуированного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 - штамм-антиген должна отмечаться выработка противовирусных антител в титре не ниже 1128 в РНГА. Таким образом, аттенуированный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота-1 КМИЭВ - 123 штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, кроме того, заявляемый штамм обладает более высокой биологической активностью по сравнению с прототипом - 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3 (у прототипа - 5,5-6,0 ТЦД 50/см 3), антигенной активностью - 1128 в РГА(у прототипа - 164) и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. 18414 1 2014.08.30 Источники информации 1. Красочко П.А. и др. Болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. П.А.Красочко. - Минск Бизнесофсет, 2005. - С. 32. 2. Патент 2059415, МПК 661 39/265, 1996. 3. Патент 30385 А, МПК 612 7/00, 2000. 4. Патент 67257, МПК 612 7/00,12 1/93,61 39/15,61 31/14,12 1/70, 2004. 5. Патент 2221040, МПК 712 7/00, А 61 КЗ 9/265, 2004. 6. Патент 2090210, МПК 6 А 61 К 3 9/265,12 5/06,12 7/00, 1997. 7. Патент 26677, МПК 612 7/00, А 61 К 39/265, 2007. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7