Аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота Bovine parainfluenza virus КМИЭВ – V124 – штамм-антиген

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТАКМИЭВ - 124 - ШТАММ-АНТИГЕН(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Красочко Ирина Александровна Ломако Юрий Васильевич Яромчик Ярослав Петрович Борисовец Дмитрий Сергеевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2182494 1, 2002.10696 1, 2008. КОТ Н.И. Иммунопрофилактика заболеваний, вызванных вирусами инфекционного ринотрахеита, диареи и парагриппа-3 крупного рогатого скота Автореф. дис. - Минск, 2003. - С. 12-13.2212896 2, 2003.2279473 1, 2006.(57) Аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скотаКМИЭВ - 124 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, а также к биотехнологии и может быть использовано при конструировании биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения парагриппа-3 крупного рогатого скота. Парагрипп-3 крупного рогатого скота - острое контагиозное заболевание крупного рогатого скота (преимущественно молодняка до 6-месячного возраста), характеризующееся катарально-гнойным поражением органов дыхания, лихорадкой, общим угнетением, приступами сухого болезненного кашля, катаральным конъюнктивитом. Данное заболевание наносит значительный экономический ущерб из-за гибели и выбраковки животных, снижения продуктивности и нарушения воспроизводства 1. В настоящее время известен ряд штаммов вируса парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота, используемых для изготовления вакцинных и диагностических биопрепаратов. Известен штаммПТК-45/86 вируса ПГ-3 крупного рогатого скота, используемый для изготовления вакцины Тривак для профилактики инфекционного ринотрахеита, ПГ-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота. Известный штамм культивируют на первично-трипсинизированной культуре клеток почки теленка (ПТ) в течение 72-96 ч, инфекционный титр вируса - 5,0-7,0 ТЦД 50/мл 2. Инфекционный титр вируса это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. 18411 1 2014.08.30 Недостатками известного штамма являются его низкая иммуногенная активность и высокая реактогенность для телят 1-3-месячного возраста. Кроме того, процесс приготовления клеточного сырья для культивирования известного штамма характеризуется трудоемкостью и нестабильностью за счет трипсинизации ткани животных и сезонности получения этой ткани. Известен производственный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота ГКВ 2334, депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, культивируемый в первичных и перевиваемых культурах клеток (почки,легкие), полученных из тканей и органов крупного рогатого скота. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-9,0 ТЦД 50/см 3 3. Недостатком известного штамма является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на его основе вакцинных препаратов, обусловленная тем, что известный штамм не обеспечивает формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов вируса ПГ-3 крупного рогатого скота, циркулирующих в хозяйствах Республики Беларусь. За прототип взят штамм ВГНКИ-4 ДЕП вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, который выделен из легких 2-3-месячных телят с респираторной патологией путем адаптации к перевиваемой культуре клеток почек теленка Таурус-1, депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) под регистрационным наименованием ВГНКИ-4 ДЕП. Штамм ВГНКИ-4 ДЕП вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота характеризуется следующими признаками и свойствами. Назначение. Штамм ВГНКИ-4 ДЕП вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота используется для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Таксономическая принадлежность. Относится к семейству , роду, подтипу 3. Морфологические свойства. РНК-содержащий вирус обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ПГ-3 полиморфной, слегка овальной формы, размер вириона варьирует от 150 до 250 нм. Вирион состоит из оболочки и внутреннего компонента, который представлен рибонуклеопротеидной спиралью. Коэффициент седиментации -1000 в градиенте сахарозы. Имеет 7 структурных белков 1) фосфопротеины (, мол. м. 83 кД) 2) ГА - нейраминидазный гликопротеин (,мол. м. 69 кД) 3) главный нуклеокапсидный протеин (, мол. м. 66 кД) 4) гликопротеин(, мол. м. 55 кД) 5) матричный белок (М, мол. м. 38 кД) 6) белок -полимераза (мол. м. 180 кД) 7) клеточный активный белок А (мол. м. 43 кД). Антигенная активность. Штамм ВГНКИ-4 вируса ПГ-3 агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, коровы, мыши, овцы, козы, человека, белой мыши. Клетки, инфицированные вирусом ПГ-3 из штамма ВГНКИ-4, сорбируют эритроциты морской свинки, крупного рогатого скота, овцы, кролика и белой мыши. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител на 8-14 сутки после прививки, антитела достигают пика к 16-28 дню и сохраняются до одного года. Привитые телята с титром гуморальных антител 6,3-10,3 2 устойчивы к заражению вирусом ПГ-3. Биотехнологические характеристики. Штамм ВГНКИ-4 вируса ПГ-3 репродуцируется в культурах клеток ПЭК, ПТ, , ВНК-21, ПС и накапливается в титрах 5,0-7,5 ТЦД 50/см 3. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла или раствор Хенкса без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при 6,7-7,2. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,5-1,0 ТЦД 50/см 3. Культивирование вируса ведут при температуре 36-37 С в течение 24-32 ч до появления ЦПД на 80-90 . Стабильность основных признаков штамма при длительном хранении. Вирус является стабильным. 2 18411 1 2014.08.30 Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Безвредность. Вирус является безвредным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Устойчивость к внешним факторам. Вирус ПГ-3 штамма ВГНКИ-4 быстро разрушается под действием высокой температуры. Возбудитель чувствителен к хлороформу, эфиру, формалину, детергентам 4. Недостатком данного штамма-прототипа является то, что для его культивирования используются дорогостоящие питательные среды сложного состава. Также известный штамм-прототип обладает антигенными и иммунобиологическими отличиями в сравнении с циркулирующими в животноводческих хозяйствах Республики Беларусь эпизоотическими штаммами возбудителей, поэтому вакцинные препараты, изготовленные на основе известного штамма-прототипа, будут характеризоваться более низкой профилактической эффективностью. В связи с этим актуальной остается проблема поиска новых высокоиммуногенных аттенуированных штаммов вируса ПГ-3 для производства эффективных средств диагностики, специфической профилактики и лечения парагриппа-3 крупного рогатого скота. Задачей настоящего изобретения стало получение нового производственного аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, обладающего высокой биологической, антигенной, иммуногенной активностью и высокой доминантностью над эпизоотическими штаммами. Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген на первичной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) от теленка 3,5-месячного возраста, павшего с клиническими признаками инфекционного парагриппа-3, и аттенуирован путем длительного культивирования на первичной культуре клеток ПЭК и перевиваемых культурах клеток ПТ (линия Таурус) и . Аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген депонирован в коллекции РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского и ему присвоен регистрационный номер КМИЭВ - 124. Характеристика аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген. Таксономическая принадлежность. РНК-геномный вирус, входящий в семейство, род , вид 3. Культурально-морфологические свойства. Вирусные частицы - сферической или овальной формы, имеют величину 120-240 нм. На внешней оболочке вирионов расположены шиловидные отростки, которые содержат гемагглютинин. Геном вируса представлен несегментированной однонитиевой линейной РНК с молекулярной массой 6-8 млн дальтон. Молекулярная масса вириона - 500-700 мегадальтон, коэффициент седиментации - 1000 ,плавучая плотность в градиенте плотности сахарозы - 1,19 г/см 3. При культивировании на культурах клеток ЦПД наступает в течение 72-96 ч инкубирования и характеризуется округлением клеток, зернистостью, отслоением монослоя,накапливается в титре 6,5-8,0 ТЦД 50/см 3. Физико-химические свойства. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, колебаниям среды с величинойот 3,0 до 9,0. Наиболее устойчивый при 6,8-7,5. Вирус не чувствителен к антибиотикам. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Биотехнологическая характеристика. Вирус размножается в перевиваемых культурах клетоки ПТ, первичной культуре клеток ПЭК со средним значением титра инфек 3 18411 1 2014.08.30 ционной активности вируса - 6,5-8,0 ТЦД 50/мл при соблюдении следующих параметров множественность заражения 0,01-1,0 ТЦД 50/кл, питательная среда среда Игла и среда 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Время культивирования 72-96 ч. Установленный температурный режим - 37 С, при 6,8-7,5. Стабильность. Штамм сохраняет свои свойства при выращивании на питательной среде Игла и среде 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Антигенная активность. Уровень специфических антител к аттенуированному штамму вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ 124 - штамм-антиген в сыворотках крови телят в реакции задержки гемагглютинации(РЗГА) составляет 1128. Иммуногенность. При вакцинации телят, кроликов и белых мышей инактивированной вакциной, сконструированной на основе аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген титр вируснейтрализующих антител в РЗГА составляет в среднем 7,20,2 2, 6,50,7 2 и 4,20,2 2 соответственно. Безвредность. Аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген не патогенен для телят и лабораторных животных. Сведения о криоконсервации. Аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген хранится в замороженном состоянии при температуре -20 С и ниже или в лиофилизированном виде при 24 С. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, культивируется на менее дорогих питательных средах, по сравнению с прототипом. Для репродукции прототипа требуются более дорогие и сложные по составу среды ФГМС и ГБКС на растворе Эрла или Хенкса, в отличие от заявляемого штамма. Кроме того, заявляемый штамм выделен на территории Республики Беларусь и имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, что позволяет нам достичь поставленной задачи. Таким образом, наличие в заявляемом штамме более высокого инфекционного титра вируса - 6,5-8,0 ТЦД 50/мл по сравнению с аналогичным показателем прототипа - 5,0-7,5 ТЦД 50/мл позволяет использовать заявляемый штамм для конструирования живых и инактивированных вирусных вакцин для профилактики парагриппа-3 крупного рогатого скота. Пример 1. Выделение штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген. Материалом для выделения штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген послужили участки пораженных легких от теленка возрастом 3,5 месяца, павшего с клиническими признаками парагриппа-3. Выделение штамма осуществлено на первичной культуре клеток ПЭК путем 3-х слепых пассажей и идентификацией после получения характерного для вируса ЦПД со специфической гипериммунной сывороткой в . Пример 2. Аттенуация штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген. Для снижения патогенности и сохранения антигенности проведено пассирование вируса на культуре клеток по следующей схеме 5 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК 10 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток . Пример 3. Культивирование аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген. 4 18411 1 2014.08.30 Выращивают перевиваемую культуру клетокв течение 2-3-х суток при температуре 37 С на питательной среде, состоящей в объеме 45-47 из среды Игла, 45-47 среды 199 и 6-10- сыворотки крови крупного рогатого скота, которую заражают аттенуированным штаммом вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 штамм-антиген с инфекционным титром 6,5-8,0 ТЦД 50/мл в дозе 5-6 мл на матрас (10-20 вирусных единиц на клетку) или 4-5 мл на роллер и культивируют в течение 24-48 ч при температуре 37 С при 6,8-8,0 в поддерживающей среде,состоящей в объеме 48-49 из среды Игла, 48-49- среды 199 и 2-4- сыворотки крови крупного рогатого скота, определяют микроскопическим визуальным методом наличие разрушения монослоя под действием аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген в сравнении с контролем, затем матрасы или роллеры с полученным аттенуированным штаммом вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген подвергают замораживанию при температуре 20 С на 24 ч, после чего их размораживают при температуре 37 С в течение 2-4 ч и титруют на культуре клеток . Инфекционный титр аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген после титрации на культуре клетокпо методу Рида и Менча составляет 6,5-8,0 ТЦД 50/см 3. Пример 4. Определение инфекционной активности аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 штамм-антиген. Инфекционный титр аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген определяют по методу Рида и Менча. Контроль инфекционной активности аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штаммантиген после проведения пассажей проводят на различных культурах клеток (табл. 1). Таблица 1 Инфекционная активность аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген ( ТЦД 50/мл) Культура клеток 1-й пассаж 5-й пассаж 10-й пассаж 20-й пассаж ПЭК 4,50,3 4,50,2 ПТ (линия Таурус) 4,80,4 5,00,3 5,50,3 5,00,4 5,50,3 6,00,5 8,00,6 Пример 4. Определение иммуногенной (антигенной) активности аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген. Для контроля иммуногенной (антигенной) активности аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 штамм-антиген с инфекционным титром 6,0 ТЦД 50/мл после проведения пассажей на различных культурах клеток вводят кроликам по 10,0 см 3 внутримышечно двукратно с интервалом 14 дней. Наличие антител в сыворотке крови определяют через 14 суток после вторичной вакцинации в РЗГА (табл. 2). 18411 1 2014.08.30 Таблица 2 Иммуногенная (антигенная) активность аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 штамм-антиген после проведения пассажей на различных культурах клеток (2) Культура клеток 1-й пассаж 10-й пассаж 15-й пассаж 20-й пассаж ПЭК 4,00,3 4,50,5 ПТ (линия Таурус) 4,50,6 5,00,5 5,50,8 4,00,4 5,50,6 6,00,5 6,50,7 Проводят заражение 4 телят аттенуированным штаммом вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген, который получен путем длительного культивирования на различных культурах клеток на первом этапе - 10 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК, затем 15 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) и 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток . У животных, получавших адаптированный вирус, не должно быть отмечено повышения температуры тела, энтеритов, воспаления органов дыхания. У телят через 21 день после введения аттенуированного штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген должна отмечаться выработка противовирусных антител в титре не ниже 1128 в Р 3 ГА. Таким образом, аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота- 3 КМИЭВ - 124 - штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, кроме того, заявляемый штамм обладает более высокой биологической активностью по сравнению с прототипом - 6,5-8,0 ТЦД 50/см 3 (у прототипа - 5,0-7,5 ТЦД 50/см 3), заявляемый штамм культивируется на менее дорогих питательных средах (среда Игла и 199), в то время как для репродукции прототипа требуются более дорогие и сложные по составу среды ФГМС и ГБКС на растворе Эрла или Хенкса, и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. Источники информации 1. Красочко П.А. и др. Болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. П.А.Красочко. - Минск Бизнесофсет, 2005. - С. 45. 2. Патент 2111011, МПК 661 39/295,61 39/15,61 39/155,61 39/265,1998. 3. Патент 2111011, МПК 661 39/295,61 39/15,61 39/155,61 39/265,1998. 4. Патент 2182494, МПК 761 39/155, 2002 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6

МПК / Метки

МПК: C12R 1/93, C12N 7/08

Метки: крупного, скота, штамм-антиген, штамм, кмиэв, рогатого, парагриппа-3, bovine, аттенуированный, вирус, вируса, parainfluenza

Код ссылки

<a href="https://by.patents.su/6-18411-attenuirovannyjj-shtamm-virusa-paragrippa-3-krupnogo-rogatogo-skota-bovine-parainfluenza-virus-kmiev-v124-shtamm-antigen.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Аттенуированный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота Bovine parainfluenza virus КМИЭВ &#8211; V124 &#8211; штамм-антиген</a>

Похожие патенты