Аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скота Bovine rotavirus КМИЭВ – V116 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ РОТАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТАКМИЭВ - 116 ШТАММ-АНТИГЕН(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Ломако Юрий Васильевич Красочко Ирина Александровна Яромчик Ярослав Петрович Борисовец Дмитрий Сергеевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2264458 1, 2005. ГОЛОВКО А.Н. и др. Ученые записки Витебской государственной академии ветеринарной медицины. - Т. 34. - Витебск, 1998. - С. 118-120. ЯРОМЧИК Я.П. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины, 2009. Т. 45. - Вып. 1. - Ч. 1. - С. 180-184. КРАСОЧКО П.А. и др. Эпизоотология,иммунобиология, фармакология, санитария. - 2009. -2. - С. 74-78.2145236 1, 2000.95108752 1, 1997.(57) Аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, а также к биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Ротавирусная инфекция телят ( ,, зимняя диарея,дизентерия телят) - остропротекающая, инфекционная болезнь новорожденных телят первых часов и суток жизни, характеризующаяся профузным поносом, дегидратацией организма, развитием катарально-геморрагического энтерита и высокой летальностью. Болезнь широко распространена во всех странах мира и наносит большой экономических ущерб промышленному скотоводству, ежегодно в молочно-товарных фермах разных стран заболевает около 40-90 новорожденных телят и при этом около трети их гибнет в первые дни жизни. Возбудитель ротавирусной инфекции вызывает заболевание у различных возрастных групп животных, однако наиболее тяжело это заболевание протекает у новорожденных телят до 2-недельного возраста. У новорожденных телят заболевание характеризуется по 18412 1 2014.08.30 ражением желудочно-кишечного тракта (энтериты), симптомами общей интоксикации и высокой летальностью. Особенностью возбудителя ротавирусной инфекции является длительная персистенция ротавируса в организме лактирующих коров, а также его высокая устойчивость во внешней среде. В зарубежной и отечественной практике известен ряд штаммов ротавируса, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Известен штамм ротавируса крупного рогатого скота под регистрационным номером ТЕ 87-ДЕП серотипов 87. Для репродукции данного штамма используют перевиваемые линии клеток почки быкаи почки макаки резус (-145). Культивирование вируса осуществляется в течение 72-96 ч до накопления вирусной биомассы со значением инфекционного титра вируса не ниже 4,5 ТЦД 50/мл 1. Инфекционный титр вируса это- количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Недостатком данного штамма является то, что его применяют только для изготовления диагностических препаратов. Данный штамм ротавируса не аттенуирован и является патогенным для сельскохозяйственных и лабораторных животных. Экспериментально не подтверждена возможность его использования для изготовления вакцин против ротавирусной инфекции. Теоретически он может быть использован для изготовления только инактивированных вакцин, однако его достаточно низкие показатели биологической активности(инфекционный титр 4,5 ТЦД 50/мл) не позволяют получить иммуногенный и эффективный биопрепарат для специфической профилактики ротавирусной инфекции. Известен штамм ротавируса -11, выращенный на перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышкии используемый для изготовления вакцины против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота с производным платины с полианионом ДНК в концентрации (5,3-81)10-3 (в пересчете на платину) 2. Недостатками данного штамма являются его достаточно невысокая антигенная активность (164 в РНГА ГАЕ/0,25 мл) и биологическая активность 5,5-7,5 ТЦД 50/мл, что обуславливает его низкую доминантность над эпизоотическими штаммами, а также высокие материальные затраты при производстве вакцины против ротавирусной инфекции с известной технологией конструирования вакцины. За прототип взят штамм ротавируса крупного рогатого скота 101 ВНИИЗЖ-ДЕП. Штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ МСХ РФ под регистрационным 101 ВНИИЗЖ-ДЕП. Штамм 101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса крупного рогатого скота характеризуется следующими признаками и свойствами. Назначение. Штамм ротавируса крупного рогатого скота 101 ВНИИЗЖ-ДЕП используется для диагностики и производства средств лечения и профилактики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Морфологические свойства. Штамм 101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса крупного рогатого скота относится к семейству , родуи обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции крупного рогатого скота сферическая форма диаметром 65-75 нм, имеющая вид колеса. Вирион состоит из сердцевины, внутреннего и наружного капсида. Сердцевина диаметром 40-45 нм имеет гексагональную форму и состоит из 3-х белков (1, 2 и 3) и РНК. Внутренний капсид(диаметр 15-20 нм) имеет икосаэдрическую форму и построен из 260 морфологических единиц, каждая из которых представлена белком 6. Наружный капсид представлен белком 7. На поверхности наружного капсида расположены выступы, представленные димером белка 4. Антигенные свойства. Антиген ротавируса крупного рогатого скота штамма 101 ВНИИЗЖ-ДЕП индуцирует в организме иммунизированных морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции диффузионной преципитации (РДП) в разведениях от 132 до 1128 и от 132 до 1256 соответственно. В имму 2 18412 1 2014.08.30 ноферментном анализе (ИФА) сыворотки положительно реагируют в разведении от 1128 до 12048, в реакции связывания комплемента (РСК) - от 140 до 1160. В сыворотках крови глубокостельных коров через 10 дней после второй вакцинации антитела к ротавирусу в ИФА выявляют в титрах 8,5-10,5 2 и 10,6-14,0 2 в молозиве. Скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител(7,0-8,5 2) в организме телят. Штамм 101 ВНИИЗЖ-ДЕП обладает широким антигенным спектром и доминантностью. Средний показатель двустороннего антигенного родства ( ) предлагаемого штамма в РН с 12 эталонными и эпизоотическими штаммами ротавируса крупного рогатого скота составляет 56,3 . Биотехнологическая характеристика. Штамм 101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса крупного рогатого скота предназначен для изготовления инактивированных вакцин против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота, диагностических антигенов и сывороток, а также лечебных препаратов антител из желтков яиц кур, иммунизированных ротавирусом крупного рогатого скота. Штамм 101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса крупного рогатого скота проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминантностью по отношению к полевым штаммам. Вирус штамма 101 ВНИИЗЖ-ДЕП репродуцируется в монослойных перевиваемых культурах клеток , СПЭВ, ПСГК-30, , -104, и в течение 24-48 ч инкубирования накапливается в титрах 5,5-7,5 ТЦД 50/см 3. Штамм 101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса крупного рогатого скота сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в культурах клеток. Устойчивость к внешним факторам. Штамм 101 ВНИИЗЖ-ДЕП ротавируса крупного рогатого скота устойчив к хлороформу, фреону, эфиру, трипсину, кислой ( 4,0) и щелочной среде ( 8,0). Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает. Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культурах клеток в течение 20 пассажей 3. Недостатком данного штамма является то, что он обладает менее высокой антигенной активностью (сыворотки положительно реагируют в разведении в РСК - от 140 до 1160) и, соответственно, изготовленная на его основе вакцина характеризуется более низкой профилактической и иммунологической эффективностью при проведении специфической профилактики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Недостатком данного штамма являются его антигенные отличия от эпизоотических изолятов ротавирусов крупного рогатого скота, выделенных на территории Республики Беларусь и стран СНГ, и, как следствие, недостаточная профилактическая эффективность при применении изготовленных с его использованием биопрепаратов против отличающихся вариантов возбудителя ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. В связи с этим актуальной остается проблема выделения новых циркулирующих на территории Республики Беларусь штаммов ротавируса для производства высокочувствительных и специфических средств диагностики, разработки иммуногенных и безвредных способов профилактики и лечения ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Задачей настоящего изобретения стало получение нового аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скота, циркулирующего на территории Республики Беларусь и обладающего высокой биологической, антигенной, иммуногенной активностью и широким антигенным спектром, что позволит ему доминировать над эпизоотическими штаммами. Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм- штаммантиген от теленка 5-дневного возраста, больного энтеритом ротавирусной этиологии на первичной культуре клеток ПЭК, впоследствии аттенуированный путем длительного культивирования на первичной культуре клеток ПЭК и перевиваемых культурах клетоки СПЭВ. 3 18412 1 2014.08.30 Аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скота - штамм-антиген депонирован в коллекции РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского и ему присвоен регистрационный номер КМИЭВ - 116. Характеристика аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген. Таксономическая принадлежность. РНК-геномный вирус, входящий в семейство , род , вид. Культурально-морфологические свойства. РНК-содержащий вирус, вирионы диаметром 60-66 нм. На поверхности имеет выступы. По своим антигенным свойствам аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген относится к группе А, серотипам 87. Нуклеиновая кислота представлена 11 сегментами двунитевой РНК с мол. массой от 0,2 до 2,2 МД. Коэффициент седиментации 525-535 . Плотность в градиенте хлористого цезия 1,38 г/см 3. Обнаружены гены, которые кодируют структурные (1,2, 3, 4, 5, 6, 7) и неструктурные (1, 2, 3, 4, 5) белки. При культивировании на культурах клеток вызывает цитопатический эффект в виде округления отдельных клеток, появлением зернистости, серповидных клеток, отслоением монослоя в течение 24-48 ч. Среднее значение титра инфекционной активности в культурах клеток составляет 6,5-8,0 ТЦД 50/мл. Физико-химические свойства. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, колебаниям среды с величинойот 3,0 до 9,0. Вирус не чувствителен к антибиотикам. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Биотехнологическая характеристика. Вирус размножается в перевиваемых культурах клетоки СПЭВ, первичной культуре клеток ПЭК со средним значением титра инфекционной активности 6,5-8,0 ТЦД 50/мл при соблюдении следующих параметров множественность заражения 0,01-1,0 ТЦД 50/кл, питательная среда среда Игла и среда 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Время культивирования 24-48 ч. Установленный температурный режим - 37 С, при 6,8-8,0. Стабильность. Штамм сохраняет свои свойства при выращивании на питательной среде Игла и среде 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Антигенная активность. Уровень специфических антител к аттенуированному штамму ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген в сыворотках крови стельных коров на 21 день после вакцинации в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) достоверно достигает значения 7,20,2 2, а у новорожденных телят,при выпойке им первых порций молозива достоверно достигало значения 8,80,24 2. При проведении иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки положительно реагировали в разведениях от 8,0 до 12,0 2, в реакции связывания комплимента (РСК) - от 1160 до 1640. Иммуногенность. При вакцинации телят, кроликов и белых мышей инактивированной вакциной на основе аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген титр вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации (РН) составляет в среднем 8,20,24 2, 6,90,34 2 и 5,40,57 2 соответственно. Безвредность. Аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген не патогенен для телят и лабораторных животных. Сведения о криоконсервации. Аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген хранится в замороженном состоянии при температуре 20 С и ниже или в лиофилизированном виде при 24 С. 4 18412 1 2014.08.30 Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм имеет высокую биологическую активность, по сравнению с прототипом. Так, инфекционный титр заявляемого аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген на культурах клеток достигает 6,5-8,0 ТЦД 50/см 3, тогда как у прототипа - 5,5-7,5 ТЦД 50/см 3, антигенная активность заявляемого штамма при проведении вакцинации коров в ИФА составила от 8,0 до 12,0 2, тогда как в прототипе данный показатель составил 8,0-10,0 2, при постановке РСК с сыворотками крови вакцинированных коров в сравнении с прототипом нами получены титры антител от 1160 до 1640, полученные данные выше таковых показателей в известном штамме (140-1160), что позволяет достичь поставленной задачи. Пример 1. Выделение штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген. Материалом для выделения штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антигена послужили участки пораженного кишечника от теленка возрастом 5 дней, павшего с клиническими признаками ротавирусной инфекции. Выделение штамма осуществлено на первичной культуре клеток почки эмбриона коровы(ПЭК) путем 3-х слепых пассажей и идентификацией после получения характерного для вируса ЦПД со специфической гипериммунной сывороткой в реакции нейтрализации (РН). Пример 2. Аттенуация штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген. Для снижения патогенности и сохранения антигенных характеристик проведено пассирование вируса на культурах клеток по следующей схеме 5 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК 10 пассажей на перевиваемой культуре клеток 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток СПЭВ. Пример 3. Культивирование аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген. Выращивают перевиваемую культуру клеток СПЭВ в течение 2-3-х суток при температуре 37 С на питательной среде, состоящей в объеме 45-47 из среды Игла и 45-47 среды 199 и 6-10- сыворотки крови крупного рогатого скота, которую заражают аттенуированным штаммом ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ 116 - штамм-антиген с инфекционным титром - 6,5-8,0 ТЦД 50/мл, в который перед заражением вносят трипсин в количестве 15-18 мкг/см 3, причем ротавирус крупного рогатого скота вносят в культуру клеток СПЭВ в дозе 5-6 мл на матрас (10-20 вирусных единиц на клетку) или 4-5 мл на роллер и культивируют в течение 24-48 ч при температуре 37 С при 6,8-8,0 в поддерживающей среде, состоящей в объеме 48-49 из среды Игла,48-49- среды 199 и 2-4- сыворотки крови крупного рогатого скота, в которую вносят трипсин в количестве 5-8 мкг/см 3, определяют микроскопическим визуальным методом наличие разрушения монослоя под действием аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген в сравнении с контролем, затем матрасы или роллеры с полученным аттенуированным штаммом ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген подвергают замораживанию при температуре 20 С на 24 ч, после чего их размораживают при температуре 37 С в течение 2-4 ч и титруют на культуре клеток СПЭВ. Инфекционный титр аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген после титрации на культуре клеток по методу Рида и Менча составляет 6,5-8,0 ТЦД 50/см 3. Пример 4. Контроль инфекционной активности аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген. Инфекционный титр аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген определяют по методу Рида и Менча. 5 18412 1 2014.08.30 Контроль инфекционной активности аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген после проведения пассажей проводили на различных культурах клеток (табл. 1). Таблица 1 Инфекционная активность аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антигена ( ТЦД 50/мл) Культура клеток ПЭК Пример 5. Определение иммуногенной (антигенной) активности аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штаммантигена. Для контроля иммуногенной (антигенной) активности аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген с инфекционным титром 6,5 ТЦД 50/мл после проведения пассажей на различных культурах клеток вводят кроликам по 5,0 см 3 внутримышечно двукратно с интервалом 14 дней. Наличие антител в сыворотке крови определяют через 14 суток после вторичной вакцинации в реакции нейтрализации (табл. 2). Таблица 2 Иммуногенная (антигенная) активность аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген после проведения пассажей на различных культурах клеток (2) Культура клеток ПЭК Аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген 1-й пассаж 10-й пассаж 15-й пассаж 20-й пассаж 4,00,4 5,00,4 4,00,2 5,50,4 6,00,3 4,50,2 6,00,4 6,50,2 8,50,4 В условиях животноводческого хозяйства проведено заражение 5 коров аттенуированного штамма ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 штамм-антиген, который был получен путем длительного культивирования на различных культурах клеток на первом этапе - 5 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК, затем 10 пассажей на перевиваемой культуре клетоки 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток СПЭВ. У животных, получавших адаптированный вирус, не отмечено повышения температуры тела, энтеритов, воспаления органов дыхания. В сыворотках крови стельных коров на 21 день после вакцинации в РНГА уровень специфических антител к аттенуированному штамму ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген достоверно достигал значения 7,20,2 2, а у новорожденных телят при выпойке им первых порций молозива достоверно достигал значения 8,80,24 2. Таким образом, аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скотаКМИЭВ - 116 - штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, кроме того, заявляемый штамм обладает более высокой биологической активностью по сравнению с прототипом - 6,5-8,0 ТЦД 50/см 3 (у прототипа 5,5-7,5 ТЦД 50/см 3), антигенной активностью - от 8,0 до 12,0 2 (у прототипа - 8,0-10,0 2) и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. 6 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7