Аттенуированный штамм вируса парвовирусного энтерита Canine parvovirus КМИЭВ-14В – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТАКМИЭВ-14 В - ШТАММАНТИГЕН(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Ковалев Николай Андреевич Бучукури Джемал Владимирович Усеня Михаил Михайлович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(57) Аттенуированный штамм вируса парвовирусного энтеритаКМИЭВ 14 - штамм-антиген. Изобретениие относится к области вирусологии и может быть использовано в биологической промышленности для приготовления вакцины и в ветеринарии для профилактики парвовирусного энтерита собак и других плотоядных. Известен штамм парвовирусного энтерита 916, который выделен из кишечного тракта больной собаки и адаптирован к первичной культуре клеток , к культуре клеток (-64) легких норки, к культуре клеток ( 150) кошачьих легких и к культуре клеток (72) тестикулы крупного рогатого скота (КРС), для выращивания которого применяются в биопромышленности питательные среды - 199, Игла , ИглаД. Вирус накапливается в культуре клеток в титрах 105,0-105,5 ТКИД в мл. Время максимального накопления вируса 4-6 суток 1. Известен штамм рекомбинантного парвовирусного энтерита собак 6223 для приготовления субъединичной вакцины против парвовирусного энтерита собак. Для репродукции данного вируса применяются питательные среды-199, Игла , ИгаД 2. Недостатком известных вышеописанных культуральных аттенуированных штаммов парвовирусного энтерита является прежде всего то, что для репродукции известных штаммов необходимы сложные и дорогостоящие среды. Так, для культивирования в этом случае применяются дорогостоящие питательные среды - 199, Игла , Игла,среда Лейбович и культивируются при 33 С, кроме того, приготовленные на их основе вакцины являются живыми для парентерального введения собакам, что может привести к поствакцинальным осложнениям. 18099 1 2014.04.30 За прототип взят аттенуированный штамм вируса парвовирусного энтерита-154 - штамм-антиген, который имеет следующие признаки и свойства. Таксономическая принадлежность - относится к роду, семейство. Патогенность для животных - вирус глубоко аттенуирован, не обладает реверсибельностью, не патогенен для собак. При введении подкожно белым мышам не вызывает их гибель, при введении парентерально может вызвать температурную реакцию у целевых животных. Культурально-морфологические признаки. Вирус размножается в культуре клеток на фибробластах кошачьего эмбриона и собачьих перевиваемых клетках, агглютинирует эритроциты свиней, вызывает ЦПД в кошачьих и собачьих перевиваемых клетках, накапливается в титрах 103-105 ТКИД. Антигенный состав. Имеет в своем составеигликопротеины, которые индуцируют выработку вируснейтрализующих антител. Антигенные свойства. На культуре клеток накапливается в титрах 103-104 ТКИД, что соответствует 6-7 2,агглютинирует свиные эритроциты. Иммуногенность - колостральный иммунитет у щенков от привитых животных сохраняется до 12 недель, а иммунитет у привитых собак достигает 6,0 2 на 21 день после иммунизации живой вакциной. Другие особенности и маркерные свойства. Штамм может ассоциироваться с другими антигенами, депонирован в Национальном музее микроорганизмов в Париже. Штамм представляет аттенуированный вирус парвовирусного энтерита. Вирус пассируется при 37 С, лиофилизацию переносит удовлетворительно с одним или с двумя стабилизаторами, инактивируется формальдегидом, бетапрорпиолактоном и другими органическими растворителями, кроме того, вирус можно инактивировать УФ-лучами, гамма- и рентгеновским излучением, сорбируется на адъювантах. Вирус агглютинирует эритроциты свиней при 7,2. Производит характерные внутриядерные включения в культуре клеток и производит характерное ЦПЭ, штамм способен реплицироваться на различных клеточных культурах 3. Указанный штамм обладает недостатком - сравнительно низкой иммуногенностью 6,0 2, обладает сравнительно высокой вирулентностью, штамм при введении парентерально в живом виде может вызвать температурную реакцию у целевых животных, для выращивания вируса парвовирусного энтерита на культуре требует сложных дорогостоящих питательных сред Лейбович, Иглаи др. Задачей настоящего изобретения является выделение и селекционирование штамма,обладающего высокой иммуногенностью, позволяющей конструировать на его основе высокоэффективную инактивированную вакцину, и низкой вирулентностью, способствующей созданию прочного противо- и парвовирусного иммунитета у привитых животных. Поставленная задача достигается тем, что полевой вирус парвовирусного энтерита собак выделен из каловых масс от больной собаки предположительно парвовирусным энтеритом, для этого делается его 10 разведение на питательной среде , добавляется антибиотик 200 г/мл, тщательно переметывается и центрифугируется при 4-8 С в течение 20 мин. Сливается надосадочная жидкость и хранится при 4 С в течение 16-24 ч. После чего путем внесения посевного материала - надосадочной жидкости на монослой первичной культуры клеток почки щенка добавляется поддерживающая средав зависимости от объема матраса, и инкубируется при 37 С в течение 4-9 суток, и замораживается при 18-20 С до следующего пассажа. Таким образом, делается 5-7 пассажей. После 5-7 пассажей вируссодержащая жидкость вносится на монослой перевиваемой культуры клеток кошачьей почкии проводится 28-33 последовательных пассажей. 2 18099 1 2014.04.30 На 28-м пассаже титр вируса парвовирусного энтерита в РГА (реакция гемагглютинации) со свиными эритроцитами составил 8,0-9,0 2/мл. В результате проведенных операций был селекционирован аттенуированный вирус парвовирусного энтерита собак, которому был присвоен регистрационный номер официальной коллекции - депозитария КМИЭВ-14 В. Вирус производит характерный цитопатический эффект (ЦПЭ) на монослой перевиваемой культуры клеток кошачьей почкина 4-9-е сутки инкубации. Селекционированный аттенуированный штамм парвовирусного энтерита собак КМИЭВ 14 В - штамм- антиген обладает следующими признаками. Таксономическая принадлежность - относится к роду, семейство. Патогенность для животных - вирус аттенуирован на культуре клеток, не обладает реверсибельностью, не патогенен для собак, патогенен для щенков. При введении подкожно в дозе 0,5 см 3 белым мышам не вызывает их гибель. Культурально-морфологические признаки. Вирус размножается в первичной культуре клеток почки собаки, в перевиваемой культуре клеток почки кошачьего эмбриона и в собачьих перевиваемых клетках. Антигенный состав. Имеет в своем составеигликопротеины, которые индуцируют выработку вируснейтрализующих антител. Антигенные свойства. На перевиваемой культуре почки кошачьего эмбриона вирус накапливается в титрах 8,0-9,0 2. Агглютинирует свиные эритроциты. Максимальное накопление вируса в культуре клеток происходит в течение 4-9 суток. Иммуногенность - колостральный иммунитет у щенков от животных, привитых инактивированной вакциной, изготовленной из указанного штамма, сохраняется до 12 недель,а иммунитет у привитых собак достигает 6,0 2 на 21-й день после двукратной иммунизации. Другие особенности и маркерные свойства. Аттенуированный штамм может ассоциироваться с другими антигенами, депонирован в музее микроорганизмов РУП ИЭВ им. С.Н. Вышелесского, аттенуированный штамм представляет аттенуированный вирус парвовирусного энтерита. Вирус пассируется при 37 С, лиофилизацию переносит удовлетворительно с одним или с двумя стабилизаторами, инактивируется формальдегидом, бета-прорпиолактоном и другими органическими растворителями, кроме того, вирус можно инактивировать УФ-лучами, сорбируется на адъювантах. Вирус агглютинирует эритроциты свиней при 7,2. Производит характерные внутриядерные включения в культуре клеток и характерный ЦПЭ, штамм способен реплицироваться на различных клеточных культурах. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что был выделен и селекционирован аттенуированный штамм вируса парвовирусного энтерита- штамм-антиген, обладающий по сравнению с прототипам (6,0-7,0 2) более высоким титром до инактивации (8,0-9,0 2), что позволяет его использовать для конструирования инактивированной вакцины, обладающей сравнительно высокой иммуногенностью. Пример 1. Выделение штаммаКМИЭВ-14 В. Полевой вирус парвовирусного энтерита собак был выделен из каловых масс от собаки, больной предположительно парвовирусным энтеритом, для этого делается его 10 разведение на питательной среде , добавляется антибиотик 200 г/мл, тщательно перемешивается и центрифугируется при 4-8 С в течение 20 мин. Сливается надосадочная жидкость и хранится при 4 С в течение 16-24 ч. После чего путем внесения посевного материала - надосадочной жидкости на монослой первичной культуры клеток почки щенка добавляется поддерживающая средав зависимости от объема матраса, и инкубируется при 37 С в течение 4-9 дней, и замораживается при 18-20 С до следующего пассажа. Таким образом, делается 5-7 пассажей. После 7 пассажей титр вируса парвови 3 18099 1 2014.04.30 русного энтерита в РГА (реакция гемагглютинации) со свиными эритроцитами составил 5,0-7,0 2/мл. Пример 2. Селекционирование штамма. После 5-7 пассажей по методу в примере 1 вируссодержащая жидкость вносится на монослой перевиваемой культуры клеток кошачьей почкии проводится 28-33 последовательных пассажей. На 28-м пассаже титр вируса парвовирусного энтерита в РГА(реакция гемагглютинации) со свиными эритроцитами составил 8,0-9,0 2/мл. В результате проведенных операций был селекционирован аттенуированный вирус парвовирусного энтерита собак. Вирус производит характерный цитопатический эффект (ЦПЭ) на монослой перевиваемой культуры клеток кошачьей почкина 4-9-е сутки инкубации. Пример 3. Определение инфекционной активности селекционированного вируса парвовирусного энтерита. Инфекционную активность указанного штамма проверяли в реакции гемагглютинации(РГА). На пластиковых микропланшетах с -образным дном вносили свежую 1 -ную взвесь свиных эритроцитов, в которые добавляли вирус в разведении 12 до 11024. Реакцию ставили при 4 С в течение 40-60 мин. Реакцию учитывали по агглютинации эритроцитов, и титр выражали в 2, который составил 8,0-9,0 2 Пример 4. Определение контаминации бактериями и грибами. Сущность метода. Выделение микрофлоры путем инкубирования питательной среды,в которую внесена вакцина. Для проверки селекционированного штамма на контаминацию бактериями и грибами вакцину из двух флаконов высевают в пробирки с МПА под вазелиновым маслом, агаром Сабуро по 0,5 мл во флаконы с МПБ и МППБ под вазелиновым маслом по 1 мл. Посевы вируса проводят в две пробирки и два флакона с каждой средой. Посевы инкубируют в течение трех суток, после чего из жидких МПА, МПБ и МППБ питательных сред во флаконах проводят пересев в две пробирки с МПА, МПБ и МППБ под вазелиновым маслом. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 суток, а с пересевами - в течение 7 суток при температуре 370,5 С (для агара Сабуро от 20 до 24 С). На питательных средах с посевами вакцины рост микрофлоры не был отмечен. Условия консервации. Лиофильная сушка вируссодержащей жидкости со стабилизатором сухое молоко и в защитной среде гидролизат лактальбумина с не более 3 -ной влажностью. Способы и условия хранения. Вирус в культуральной жидкости хранится замороженным от -70 до 86 С или в защитной среде гидролизат лактальбумина лиофилизированном состоянии не более 3 влажности при температуре 4-8 С. Жизнеспособность замороженного вируса поддерживается путем пассажа вируса на культуре клетокодин раз в год, а лиофилизированного вируса - один раз в 3 года, путем пассажа вируса на культуре клеток . Источники информации 1. Патент 4193991, 1994. 2. Патент 5885585, 1999. 3. Патент 5316764, 1994 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4