Аттенуированный штамм вируса бешенства Rabies virus fix КМИЭВ-V 105 – штамм-антиген, вакцина культуральная против бешенства на его основе для пероральной иммунизации плотоядного животного и способ получения вакцины

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА БЕШЕНСТВАКМИЭВ- 105 - ШТАММ-АНТИГЕН, ВАКЦИНА КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПЛОТОЯДНОГО ЖИВОТНОГО И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Гусев Анатолий Алексеевич Бабак Виктор Александрович Красочко Петр Альбинович Ероховец Нина Федоровна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56) КОВАЛЕВ Н.А. и др. Ветеринарная медицина Беларуси, 2005,1. С. 9-11. БУЧУКУРИ Д.В. и др. Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства. Материалымеждународной научно-практической конференции. - Витебск, УО ВГАВМ,2005. - С. 27-29. ИСАКОВА Н.В. и др. Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы. Материалы международной научно-практической конференции. Минск, 1997. - С. 27-28.2128519 1, 1999.3674862, 1972.1253197 1, 2006.(57) 1. Аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ- 105 - штаммантиген. 2. Вакцина культуральная против бешенства для пероральной иммунизации плотоядного животного, отличающаяся тем, что содержит аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ- 105 и глицерин, взятые в соотношении, мас.культуральная жидкость, содержащая аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ- 105 80-90 глицерин 10-20,причем аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ- 105 выращен в монослое или в суспензии клеток ВНК-21 (с-13) в питательной среде ФГМ-С/ДМЕМ с раствором Хенкса до титра 6,2-7,7550/см 3. 3. Способ получения вакцины культуральной против бешенства по п. 2 для пероральной иммунизации плотоядного животного, заключающийся в том, что культуру клеток ВНК-21 (с-13), выращенную суспензионно на питательной среде ФГМ-С/ДМЕМ с раствором Хенкса, заражают аттенуированным штаммом вируса бешенстваКМИЭВ- 105, взятым в количестве 0,1-0,5 50/кл, выращивают вирус в культуре клеток в течение 3-4 суток при температуре 37 С до титра 6,2-7,7550/см 3, отделяют 16729 1 2012.12.30 культуральную вируссодержащую жидкость и добавляют к 80-90 мас.культуральной вируссодержащей жидкости 10-20 мас.глицерина. Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в биотехнологической промышленности для приготовления вакцины и в ветеринарии для профилактики бешенства среди диких плотоядных и домашних животных. В современной ветеринарной вирусологической практике известен ряд фиксированных аттенуированных штаммов вируса бешенства для производства антирабических культуральных вакцин. Известны такие вакцинные штаммы вируса бешенства Щелково-51, адаптированный к перевиваемой линии клеток ВНК-21, клон 13, применяемый для изготовления антирабической вакцины 1 Внуково-32, адаптирован к первичной культуре клеток почки сирийского хомяка(ПСХ) и применяется в медицинской промышленности для изготовления культуральной антирабической вакцины 2. Общим недостатком известных вышеописанных культуральных аттенуированных штаммов вируса бешенства является то, что культуры клеток по ряду признаков не обеспечивают оптимальных условий получения антирабических вакцин, так как сильно аттенуированны. Для репродукции известных штаммов необходимы сложные и дорогостоящие питательные среды. Так, первичную культуру клеток ПСХ, в которой репродуцируется штамм Внуково-32, нельзя готовить ежемесячно в связи с биологическими особенностями сирийского хомяка, из почки которого готовят культуру. Монослой в них формируется в длительные сроки, пролиферативная активность клеток не высокая. Для культивирования в этом случае применяются дорогостоящие питательные среды - 199 и Игла. За прототип взят штамм Внуково-32, который имеет следующие признаки и свойства. Культуральные свойства. В культуре клеток ПК, ПСХ и КПЭ вирус размножается, не вызывая цитопатического эффекта, в период с 4-го по 10-й день инкубирования, наибольшее накопление его отмечается на 5-6-й день. Титр вируса 5,5-6,250/см 3. Состав поддерживающей питательной среды (199, Игла, ГЛХ) не оказывает существенного влияния на накопление вируса в культуре клеток, поэтому можно использовать более простую среду ГЛХ с 5 сыворотки крупного рогатого скота. Специфическая безвредность. Вирус Внуково-32 безвреден для овец, лисиц, волков и енотовидных собак. Инъекция под кожу и внутримышечно вируса в максимальных дозах не вызывает каких-либо изменений в месте введения или общей температурной реакции. Введение вируса перорально лисицам, волкам, енотовидным собакам вируссодержащего материала в объеме 150-200 см 3 также не вызывает никакой патологической реакции у животных. Иммуногенные свойства. Способствует формированию устойчивого иммунитета у лисиц, волков, енотовидных собак к летальной дозе уличного вируса бешенства при заражении в мышцу бедра. Иммунное состояние у этих животных наблюдается на 25-30-й день после однократного перорального введения им 150-20010000-100000 доз вируса. Обусловливает защиту 80-100 против фиксированного вируса бешенства в летальных дозах при внутримозговом заражении. Вирус не передается при контакте от вакцинированных к невакцинированным животным. Штамм Внуково-32 бешенства поддерживается в первичной культуре ПСХ, которая обладает хорошей пролиферативной активностью клеток, формирует монослой через 4872 ч, но не может быть получена в любое время года. Штамм сохраняется в лиофилизированном состоянии при температуре минус 40 в течение 3-5 лет (срок наблюдения). Штамм Внуково-32 вируса бешенства обладает выраженными иммуногенными свойствами. 2 16729 1 2012.12.30 Однако штамм Внуково-32 вируса имеет следующие недостатки. При репродукции на культуре клеток накапливается в низких титрах, что не позволяет получить заявляемую высокоиммуногенную вакцину. Для культивирования клеток и накопления вируса используются дорогие жидкие синтетические питательные среды, а в заявляемой вакцине предложена модифицированная среда с гидролизатом мышечных белков, более простая и дешевая по сравнению с другими питательными средами, используемыми в вирусологии. Эта же питательная среда применяется для накопления вируса. Первичную культуру клеток ПСХ, в которой репродуцируется штамм Внуково-32, нельзя готовить ежемесячно в связи с биологическими особенностями сирийского хомяка, из почки которого готовят культуру. Монослой в них формируется в длительные сроки, пролиферативная активность клеток не высокая. На известных штаммах получить заявляемую вакцину культуральную против бешенства невозможно, так как известные штаммы имеют низкий титр 5,5-6,250/см 3. Так, известна вакцина аттенуированная против бешенства, представляющая собой 5 взвесь мозговой ткани овцы, или козы, зараженной фиксированным вирусом бешенства. Вирусную суспензию обрабатывают 1 раствором фенола. Эта вакцина изготовлена на основе фиксированного штамма, имеющего титр 2,750/см 3 3. Однако это вакцина имеет и другой недостаток, заключающийся в том, что вирус репродуцируется на мозговой ткани, что является дорогостоящим и трудоемким и обладает аллергенностью. Известные способы получения вакцины не позволяют получить заявляемую вакцину ввиду того, что в известных способах используются слабоиммуногенные штаммы, которые не обеспечивают выработку антител заданного уровня. Кроме того, используемые методы культивирования не позволяют масштабировать производство антирабической вакцины в силу их низкой эффективности и нерентабельности. Так, известен способ приготовления вакцины для пероральной иммунизации плотоядных животных против бешенства, включающий заражение фиксированным вирусом бешенства культуры клеток, культивирование в питательной среде, добавление защитной среды и лиофилизацию, причем в качестве фиксированного вируса бешенства используют штамм Внуково-32 с титром 5,5-6,250/см 3, которым заражают монослой первичной культуры клеток ПСХ с множественностью заражения 0,005-0,09 50/кл, добавляют питательную среду, содержащую гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса и нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота, культивирование осуществляют при 7,6-7,8 до титра 5,5-6,250/см 3, после чего вируссодержащую жидкость замораживают при(минус 20)-(минус 30) С, через 30-60 дней оттаивают и проводят лиофилизацию 4. Однако этот способ обладает недостатками, заключающимися в слабой эффективности вакцины ввиду сравнительно низкого титра в среднем 5,050/см 3, отсутствием возможности инъекции вакцины в объеме 5,0 см 3 в куриные головы или готовые полипропиленовые блистеры для приготовления съедобных приманок для диких плотоядных животных. Задачей предлагаемого изобретения является получение высокоиммуногенного штамма, на основе которого должна быть сконструирована высокоиммуногенная, сравнительно дешевая вакцина и разработан простой экономически эффективный способ ее получения. Поставленная задача достигается тем, что вакцина культуральная против бешенства для пероральной иммунизации плотоядного животного содержит аттенуированный штаммКМИЭВ- 105 и глицерин, взятые в соотношении, мас.культуральная жидкость, содержащая аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ- 105 80-90 глицерин 10-20,причем аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ- 105 выращен в монослое или в суспензии клеток ВНК-21 (с-13) в среде ФГМ-С/ДМЕМ на растворе Хенкса до титра 6,2-7,7550/см 3. Кроме того, в способе получения вакцины культу 3 16729 1 2012.12.30 ральной против бешенства для пероральной иммунизации плотоядного животного культуру клеток ВНК-21 (с-13), выращенную суспензионно на питательной среде ФГМ-С/ДМЕМ на растворе Хенкса, заражают аттенуированным штаммом вируса бешенстваКМИЭВ- 105, взятым в количестве 0,1-0,5 50/кл, выращивают вирус в культуре клеток в течение 3-4 суток при 37 С до титра 6,2-7,7550/см 3, отделяют культуральную вируссодержащую жидкость и добавляют к 80-90 мас.культуральной вируссодержащей жидкости 10-20 мас.глицерина. Таким образом, использование заявляемого штамма вируса бешенстваКМИЭВ- 105 при конструировании вакцины, обладающего высоким титром, и способ ее получения позволяют изготовить высокоиммуногенную сравнительно дешевую вакцину. Характеристика штамма- КМИЭВ- 105. Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству , род , РНК содержащий вирус. Культурально-морфологические признаки. Культивируется на перевиваемых культурах клеток монослойным или суспензионным методом. Максимальное накопление вируса наблюдается на 72-120-й час культивирования. Вирус патогенен для кроликов и белых мышей при интрацеребральном ведении. Морфологические признаки. Размер вирионов в среднем от 80 до 120 нм. Оболочка вируса имеет шипы 8-10 нм. Антигенные компоненты представленыи , создающими антирабический иммунитет. Физико-биохимические свойства. Устойчив к замораживанию,в пределах 4,5-7,8,при температуре плюс 70 С инактивируется мгновенно солнечными и ультрафиолетовыми лучами, 2-3 раствором , ацетоном, фенолом, формалином, теотропином 24,консервируется 50 глицерином, не чувствителен к антибиотикам. Молекулярно-биологические признаки. Вирион содержит 5 основных белков. При заражении белых мышей интрацеребрально в дозе 0,03 см 3 инкубационный период составляет 4 дня и вызывает гибель мышей на 5-7 день. Онкогенность. Вирус бешенства не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериями и грибами. Антигенная активность не менее 1,0 в одной дозе. Биологическая активность составляет 6,2-7,7550/см 3. Безвредность. Штамм не патогенен для диких плотоядных и собак, полевых грызунов при пероральном ведении в 10 кратной дозе. Условия консервации. Лиофильная сушка культурального материала вируса бешенства в защитной среде (при влажности не более 3 ). Способы и условия хранения. Вирус в культуральной жидкости хранится замороженным от минус 70 С до 86 С или 10 мозгового материала, культурального материала в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 от минус 18 С до минус 86 С. Жизнеспособность замороженного вируса поддерживается путем пассажей на культуре клеток один раз в год, а лиофилизированного мозгового материала один раз в 5 лет, через мозг кролика. Пример 1 Пример селекционирования аттенуированного штамма вируса бешенства- КМИЭВ- 105. Для получения заявляемого штамма использован штамм Внуково-32. Штамм-антиген последовательно пассирован через мозг мышей, а потом адаптирован к суспензионной культуре клеток ВНК-21 (с-13) до 4-6 пассажей. В 5-7 пассажах титр вируса составил 6,2-7,7550/см 3. На основе указанного штамма приготовленная антирабическая вакцина при приеме перорально у плотоядных животных вызывает образование антирабического иммунитета 16729 1 2012.12.30 через 14-21 день и предохраняет от заражения против 10-100 50 уличного вируса бешенства. Штаммом вируса Внуково-32 с титром 5,550/см 3 заражали белых мышей интрацеребрально и после смерти мышей 10 стерильной взвесью извлеченной мозговой ткани заражали культуру клеток ВНК-21 (с-13). Через 3-4 дня культуру клеток ВНК-21(с-13) замораживали, оттаивали и обратно заражали здоровых белых мышей и так несколько раз. Для заражения культуры клеток ВНК-21 (с-13) оттаивают содержимое 3-5 флаконов (объем вируссодержащего материала в каждом флаконе 8 см 3) и вносят по 8,011,0 см 3 в 3-4 роллера вместимостью 2000 см 3 с культурой клеток ВНК-21 (с-13). После контакта вируса с клетками (в течение 60-90 минут при комнатной температуре) во флаконы вносят по 200 мл поддерживающей среды, в качестве которой используют среду ФГМ-С/ДМЕМ с добавлением 5 сыворотки крупного рогатого скота ( 6,8-7,6). Флаконы герметически закрывают и инкубируют при температуре 37 0,5 С. После 3-4 суток культивирования зараженную культуру клеток промораживают при минус 20 С и ниже не менее 14-16 часов. Культуральную вируссодержащую суспензию в роллерах размораживают при комнатной температуре, сливают во флаконы и тщательно перемешивают. Пример 2 Определение инфекционной активности вируса в вакцине для пероральной иммунизации плотоядных животных против бешенства (титр). Проведение испытания. Готовят объединенную пробу вакцины из двух флаконов и из нее готовят десятикратные разведения от 10-1 до 10-8. Для этого в ряд из 8 пробирок наливают по 9,0 мл питательной среды. В первую пробирку вносят 1,0 см 3 вирусвакцины. Стерильной пипеткой перемешивают содержимое первой пробирки и 1,0 мл переносят во вторую пробирку и т.д. до конечного разведения 10-8. Каждым разведением вируса, начиная с разведения 10-8 в объеме 0,03 см 3 заражают мозг не менее 4 мышей. Срок наблюдения за мышами 15 дней. Специфической считается гибель мышей не ранее, чем на 5-е сутки после заражения при наличии типичных признаков заболевания (параличи, парезы, коматозное состояние и др. и подтверждается методом РФА). Расчет титра вируса производят по методу Рида и Менча, или по Керберу в модификации Ашмарина. Сравнительная характеристика предлагаемой вакцины и прототипа Состав вакцины и этапы получения Предлагаемая вакцина Прототип- КМИЭВ- 105 Штамм вируса- КМИЭВ- 105 Внуково-32 Культура клеток ВНК-21 (с-13) ФЭК, ПСХ Среда культивирования ФГМ-С/ДМЕМ 199, Игла, ГЛХ 3 Посевная концентрация клеток 0,1-0,25 млн кл/см 0,3-0,4 млн Метод культивирования монослой суспензия монослой Время подращивания культуры 48-72 ч Время культивирования 3-4 суток 5-6 суток Инфекционная активностьТКИД 50/см 3 6,2-7,75 5,5-6,2 Иммуногенность (МЕ) 1,0-1,3 0,7-1,0 Пример 3 Определение контаминации бактериями и грибами вакцины. Сущность метода. Выделение микроорганизмов путем инкубирования питательной среды, в которую внесена вакцина. Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие определенных микроорганизмов. Готовить питательные среды следует строго придерживаясь приведенной рецептуры. Компоненты питательных сред должны соответствовать ГФХ 1, вып. 2. 5 16729 1 2012.12.30 Состав и приготовление питательных сред. Среда 1 - для выращивания бактерий пептона ферментативного сухого, ГОСТ 13805 10 г натрия хлорида, ГОСТ 4233 5 г глюкозы, ГОСТ 975 1 г агара микробиологического, ГОСТ 17206 13 г мясной воды (12), ГФ 11, вып. 2 1000 см 3 после стерилизации 7,30,2. К мясной воде прибавляют пептон и натрия хлорид, растворяют при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают , кипятят в течение 1 мин, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 С в течение 15 мин. Среда 2 - для выращивания грибов (Сабуро) пептона ферментативного сухого 10 г глюкоза 40 г агара микробиологического 13 г мясной воды (12) 1000 см 3 после стерилизации 5,60,2. Все ингредиенты растворяют в мясной воде, прибавляют замоченный заранее агар,нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 С в течение 15 мин. Для подавления роста бактерий после стерилизации насыщенным паром под давлением прибавляют 100 мг бензилпенициллина и 100 мг тетрациклина(либо перед стерилизацией насыщенным паром под давлением - 50 мг левомицетина) на 1000 см 3 среды. Проведение испытания контаминации вакцины. Для проверки вакцины на контаминацию бактериями и грибами вакцину из 2 флаконов объединяют. Образец вакцины высевают на питательные среды, ГФ , вып. 2. С. 196-197. Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри диаметром 90100 мм. Посевы просматривают ежедневно. Определение общего числа бактерий. Объединенная суспензия вакцины вносится по 1 см 3 в каждую из двух пробирок с 4 см 3 расплавленной и охлажденной до температуры от 45 до 50 С среды 1. Быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 см 3 застывшей питательной среды 1. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 сут. при температуре от 30 до 35 С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут. подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на два, вычисляют число бактерий в 2,0 см 3 вакцины. Определение общего числа грибов. Испытание проводят двуслойным агаровым методом, описанным выше, используя среду 2. Посевы инкубируют в течение 5 сут. при температуре от 20 до 25 С. Через 72 ч и окончательно через 5 сут. подсчитывают общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находят среднее значение,умножая его на два, и вычисляют число грибов в одной дозе вакцины. Пример 4 Способ приготовления вакцины культуральной для пероральной иммунизации плотоядного животного. Получение вируса для изготовления вакцины. При изготовлении производственных серий вакцины исходят из расчета, что каждая серия составляет 25-50 тысяч иммунизирующих доз. Для этого необходимо получить 106 16729 1 2012.12.30 20 роллеров с культурой клеток ВНК-21 (с-13) объемом 2,0 литра для накопления исходной расплодки клеток ВНК-21 (с-13) для последующего суспензионного культивирования в биореакторе. Примерный расчет потребности компонентов для изготовления 25 тыс. доз или 50 л вакцины раствор трипсина - 2,0 л питательная среда ФГМ-С/ДМЕМ (31) на растворе Хенкса - 50 л сыворотка крови крупного рогатого скота - 5 л 7,5 раствор соды - 2,0 л гентамицина сульфат 4- 50,0 мл расплодка клеток ВНК-21 (с-13) - 2-5 л (роллерный метод). Исходная концентрация 450-750 тыс. кл./см 3. посевной вирус - 1,0 л (роллерный метод). Титр вируса для заражения 6,75-7,7550/см 3 и выше. Предварительно выращивают культуру клеток ВНК-21 (с-13) и для снятия клеток отбирают роллеры с хорошо сформированным монослоем клеток без зернистости или спонтанной дегенерации (не более 48 часов роста). После удаления ростовой среды в каждый роллер с культурой клеток вместимостью 2,0 л вносят рабочий раствор трипсин/версена,снимают монослой клеток, ресуспензируют в свежеприготовленной ростовой среде ФГМ-С/ДМЕМ на растворе Хенкса и переносят в культиваторы для суспензионного выращивания. Методом продленного периодического культивирования с подпиткой культуры клеток ВНК-21 (с-13) свежей питательной средой в соответствующем объеме накапливают биомассу клеток ВПК-21 (с-13) до требуемого объема. Заражение аттенуированным штаммом вируса бешенства в количестве 0,1-0,5 50/кл проводят при концентрации клеток 500-800 тыс. кл./см 3 и инкубируют, т.е культивируют при температуре 37 С при вращении мешалки в пределах 60-120 оборотов в минуту в течение 3-4 суток, поддерживаяна уровне 6,9-7,2. Через 3-4 суток культивирования производят слив вируссодержащей жидкости в роллерные сосуды или канистры. Из каждого 20-го роллера делают высевы на бактериальную и микологическую стерильность, после этого их помещают при температуре минус 20-40 С и сохраняют до проведения титрования вируса. Не ранее чем через 16-18 часов после замораживания 2-3 роллера с вируссодержащей жидкостью оттаивают при комнатной температуре и содержимое их смешивают для приготовления объединенной пробы. Из полученной смеси берут пробу в количестве 5-10 см для титрования вируса путем интрацеребрального заражения мышей. Перед приготовлением вакцины к 80-90 мас.культуральной вируссодержащей жидкости добавляют 10-20 мас.глицерина. Таким образом, использование заявляемого штамма фиксированного аттенуированного вируса бешенстваКМИЭВ- 105, обладающего высоким титром,6,2-7,7550/см 3 (а в прототипе титр равен 5,5-6,2), при конструировании вакцины,обладающей высоким титром, и способ ее получения позволяют изготовить высокоиммуногенную экономически эффективную вакцину. Источники информации 1. Кузнецов П.П. Передовой научно-производственный опыт биологической промышленности / П.П.Кузнецов, В.С.Иванов и др. // Передовой научно-производственный опыт биологической промышленности Экспресс информация. - М., 1979. - Т. 3. - С. 3-8. 2..- 32-32-107/ ., . , , 1980. - . 64 (прототип). 16729 1 2012.12.30 3. Методы лабораторных исследований по бешенству / Третье издание. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8