Аттенуированный штамм вируса бешенства Rabies virus fix КМИЭВ-94 – штамм-антиген, вакцина культуральная на его основе для пероральной иммунизации плотоядного животного против бешенства и способ получения вакцины

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА БЕШЕНСТВАКМИЭВ-94 - ШТАММ-АНТИГЕН, ВАКЦИНА КУЛЬТУРАЛЬНАЯ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПЛОТОЯДНОГО ЖИВОТНОГО ПРОТИВ БЕШЕНСТВА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(72) Авторы Бучукури Джемал Владимирович Ковалев Николай Андреевич Гусев Анатолий Алексеевич Усеня Михаил Михайлович Красочко Петр Альбинович Савельева Тамара Александровна Буркун Татьяна Николаевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(56) УЛАСОВИЧ П.И. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. Т. 40. Ч. 1. - Витебск 2004. - С. 319-320.2128519 1, 1999.3674862, 1972.12531971, 2006. КОВАЛЕВ Н.А. и др. Ветеринарная медицина Беларуси - 2005 -1. - С. 9-11. ИСАКОВА Н.В. и др. Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы. Материалы международной научно-практической конференции. - Минск, 1997. С. 27-28. БУЧУКУРИ Д.В. и др. Исследование молодых ученых в решении проблем животноводства. Материалымеждународной научно-практической конференции. - Витебск, УО ВГАВМ, 2005. С. 27-29. КОВАЛЕВ Н.А. и др. Весц нацыянальнай акадэм навук Беларус. Серыя аграрных навук. - 2007. -2. - С. 80-87.(57) 1. Аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ-94 - штаммантиген. 2. Вакцина культуральная для пероральной иммунизации плотоядного животного против бешенства, отличающаяся тем, что содержит аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ-94 в вируссодержащей среде в титре 6,0-7,550 на 1 см 3 и глицерин, взятые в соотношении, мас.аттенуированный штамм вируса бешенстваКМИЭВ-94 в вируссодержащей среде 80-90 глицерин 10-20,причем штамм вируса бешенстваКМИЭВ-94 выращен в монослое культуры клетокили ВНК-21 в среде Игла с раствором Хенкса. 13935 1 2010.12.30 3. Способ получения вакцины культуральной для пероральной иммунизации плотоядного животного против бешенства, отличающийся тем, что культуру клетокили ВНК-21, выращенных в виде монослоя на питательной среде Игла с раствором Хенкса в течение не более 24 часов, заражают аттенуированным штаммом вируса бешенстваКМИЭВ-94, взятым в количестве 0,1-0,6 50 на 1 клетку, выращивают вирус в течение 3-4 суток при 37 С, собирают вируссодержащую жидкость, замораживают при температуре от -20 до -40 С, не менее чем через 16-18 часов оттаивают при комнатной температуре и добавляют на 80-90 мас.вируссодержащей жидкости 10-20 мас.глицерина. Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в биологической промышленности для приготовления вакцины и в ветеринарии для профилактики бешенства среди диких плотоядных и домашних животных. В современной ветеринарной практике известен ряд аттенуированных штаммов для производства антирабических культуральных вакцин, т.е. вакцин против бешенства, например известен штамм вируса бешенства Щелково-51, адаптированный к перевиваемой линии клеток ВНК-21, клон 13, применяемый для изготовления антирабической вакцины 1. Известен также штамм-Внуково 32, который адаптирован первичной культуре клеток почки сирийского хомяка (ПСХ) и применяется в медицинской промышленности для изготовления культуральной антирабической вакцины 2. Известен штамм-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ 29 для приготовления вакцины против бешенства животных 3. Недостатком известных вышеописанных культуральных аттенуированных штаммов вируса бешенства является прежде всего то, что культуры клеток по ряду признаков не обеспечивают оптимальных условий получения антрабических вакцин, так как сильно аттенуированные. Для репродукции известных штаммов необходимы сложные и дорогостоящие среды. Так, первичную культуру клеток ПСХ, в которой репродуцируется штамм Внуково 32, нельзя готовить ежемесячно в связи с биологическими особенностями сирийского хомяка, из почки которого готовят культуру. Монослой в них формируется в длительные сроки, пролиферативная активность клеток невысокая. Для культивирования в этом случае применяются дорогостоящие питательные среды - 199 и Игла. За прототип взят штамм-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ, который имеет следующие признаки и свойства. Культуральные свойства. В культуре клеток ПК, ПЭС, ПСХ и КПЭ вирус размножается, не вызывая цитопатического эффекта, в период с 4 по 12 день инкубирования,наибольшее накопление его отмечается на 5-6 день. Титр вируса 5,0-5,9 лог ЛД 50/мл. Состав поддерживающей питательной среды (199, Игла, ГЛХ) не оказывает существенного влияния на накопление вируса в культуре клеток, поэтому можно использовать более простую среду ГЛХ с 5 сыворотки крупного рогатого скота. Специфическая безвредность. Безвреден для овец, серебристо-черных, рыжих лисиц,волков и енотовидных собак. Инъекция под кожу и внутримышечно вируса в максимальных дозах не вызывает каких-либо изменений в месте введения или общей температурной реакции. Пероральное введение серебристо-черным, рыжим лисицам, волкам, енотовидным собакам вируссодержащего материала в объеме 150-200 мл также никакой патологической реакции у животных не вызывает. Иммуногенные свойства. Способствует формированию устойчивого иммунитета у лисиц, волков, енотовидных собак к летальной дозе уличного вируса бешенства при заражении в мышцу бедра. Иммунное состояние у этих животных наблюдается 25-30 день после однократного перорального ведения им 150-20010000-100000 доз вируса. Обусловливает защиту 80-100 против фиксированного вируса бешенства в летальных дозах 2 13935 1 2010.12.30 при внутримозговом заражении. Иммунное состояние у овец наблюдается на 14-20 день после внутримышечного введения им 21000 ЛД 50 вируса. Продолжительность иммунитета у животных 12 месяцев (срок наблюдения). Вирус не передается при контакте от вакцинированных к невакцинированным животным. Штамм-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ бешенства поддерживается в первичной культуре ПК, которая обладает хорошей пролиферативной активностью клеток, формирует монослой в короткие сроки (через 24-48 ч), может быть получена в любое время года. Штамм сохраняется в лиофилизированном состоянии при температуре минус 40 в течение 3-5 лет (срок наблюдения). Штамм-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ вируса бешенства обладает выраженными иммуногенными свойствами, поддерживается в первичной культуре ПК. Однако штамм-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ вируса имеет следующие недостатки. При репродукции на культуре клеток накапливается в низких титрах, что не позволяет получить заявляемую высокоиммуногенную вакцину, методика получения которой проста, монослой формируется при использовании среды с гидролизатом лактальбумина,более простой и дешевой по сравнению с другими питательными средами, используемыми в вирусологии. Эта же питательная среда применяется для накопления вируса. На известных штаммах получить заявляемую вакцину против бешенства, т.е. антирабическую культуральную вакцину, невозможно, так как известные штаммы имеют низкий титр 4,5-5,550 мл. Так, известна вакцина аттенуированная против бешенства, представляющая собой 5 взвесь мозговой ткани овцы или козы зараженной фиксированным вирусом бешенства. Вирусную суспензию обрабатывают 1 раствором фенола. Эта вакцина изготовлена на основе фиксированного штамма, имеющего титр 2,750/мл 4. Однако это вакцина имеет и другие недостатки, заключающиеся в том, что вирус репродуцируется на мозговой ткани, что является дорогостоящим и трудоемким, и обладает аллергенностью. Так, известна вакцина из аттенуированного штамма против бешенства, включающая фиксированный вирус бешенства в среде культивирования, причем в качестве фиксированного вируса бешенства в среде культивирования используют штамм-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ с титром 4,45-6,050 мл 5. Это вакцина имеет недостаток, заключающийся в том, что вакцина имеет сравнительно невысокий титр и большую иммунизирующую дозу, что не позволяет нужную дозу ввести в 2-миллилитровую блистерприманку для диких плотоядных животных. Известные способы получения заявляемой вакцины не позволяют ее получить ввиду того, что в известных способах используются слабоиммуногенные штаммы и которые не обеспечивают выработку антител заданного уровня. Так, известен способ приготовления вакцины для пероральной иммунизации плотоядных животных против бешенства, включающий заражение фиксированным вирусом бешенства культуры клеток, культивирование в питательной среде, добавление защитной среды и лиофилизацию, причем в качестве фиксированного вируса бешенства используют штамм-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ с титром 4,45-6,050/мл, которым заражают монослой первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат с множественностью заражения 0,006-0,08 ЛД 50 на клетку, добавляют питательную среду, содержащую гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса и нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота, культивирование осуществляют при рН 7,6-7,8 до титра 4,45-6,0 МЛД 50/мл, после чего вируссодержащую жидкость замораживают при (-20)-(-30) С, через 30-60 дней оттаивают и на 45,0-59,0 вируссодержащей жидкости добавляют пектин яблочный в количестве 2,0-2,5 и молоко сухое обезжиренное до 100 , после чего проводят лиофилизацию 6. 3 13935 1 2010.12.30 Однако этот способ обладает недостатками, заключающимися в слабой эффекитивности вакцины ввиду сравнительно низкого титра в среднем 4,5 МЛД 50/мл, отсутствием возможности инъекции вакцины в объеме 5,0 мл в куриные головы или готовые блистеры для приготовления съедобных приманок для диких плотоядных животных. Задачей предлагаемого изобретения является получение высокоиммуногенного штамма, на основе которого должна сконструирована высокоиммуногенная сравнительно дешевая вакцина и разработка простого дешевого способа его получения. Поставленная задача достигается тем, что вакцина культуральная для пероральной иммунизации плотоядного животного против бешенства, содержит аттенуированный штамм вируса бешенства-КМИЭВ 94-вируссодержащей среде в титре 6,07,550/см 3 и глицерин, взятых в соотношении, мас.аттенуированный штамм вируса бешенства-КМИЭВ 94 в вируссодержащей среде 80-90 глицерин 10-20,причем штамм вируса бешенства-КМИЭВ 94 выращен в монослое культуры клетокили ВНК-21 в среде Игла с раствором Хенкса. Кроме того, поставленная задача достигается тем, что в способе получения вакцины культуральной для пероральной иммунизации плотоядного животного против бешенства - культуру клетокили ВНК-21, выращеных в виде монослоя на питательной среде Игла с раствором Хенкса в течение не более 24 ч, заражают аттенуированным штаммом вируса бешенства-КМИЭВ 94 в количестве 0,1-0,650 на 1 клетку, выращивают вирус в течение 3-4 суток при 37 С, собирают вируссосодержащую жидкость, замораживают при температуре от -20 до 40 С, не менее чем через 16-18 ч, оттаивают при комнатной температуре и добавляют на 80-90 мас.вируссодержащей жидкости 10-20 мас.глицерина. Таким образом, использование заявляемого штамма бешенстваКМИЭВ 94 при конструировании вакцины, обладающего высоким титром, и способ ее получения позволяют изготовить высокоиммуногенную сравнительно дешевую вакцину. Характеристика штаммаКМИЭВ 94. Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству , род ,содержащий вирус. Культурально-морфологические признаки. Культивируется на перевиваемых культурах клеток. Как монослойным, так и суспензионным методом. Максимальное накопление вируса наблюдается на 72-120 ч культивирования. Вирус патогенен для кроликов и белых мышей при интрацеребральном введении. Морфологические признаки. Размер вирионов в среднем от 80 до 120 нм. Оболочка вируса имеет шипы 8-10 нм. Антигенные компоненты представленыи , создающие антирабический иммунитет. Физико-биохимические свойства. Устойчив к холоду,в пределах 4,5-7,8, при температуре плюс 70 С инактивируется мгновенно, солнечными и ультрафиолетовыми лучами, 2-3 раствором , ацетоном, фенолом, формалином, теотропином А 24,консервируется 50 глицерином, не чувствителен к антибиотикам. Молекулярно-биологические признаки. Вирион содержит 5 основных белков. При заражении белых мышей интрацеребрально в дозе 0,03 мл, инкубационный период составляет 4 дня и гибель мышей вызывает на 5-6-7 день. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован. Антигенная активность не менее 1,0 в одной дозе. Биологическая активность составляет 6,0-7,550/мл и выше. Безвредность. Штамм не патогенен для диких плотоядных и собак, полевых грызунов при пероральном введении в 10 кратной дозе. 13935 1 2010.12.30 Условия консервации. Лиофильная сушка 10 мозгового материала в защитной среде и не более 3 влажности. Способы и условия хранения. Вирус в культуральной жидкости хранится в замороженном от минус 70 С до минус 86 С или 10 мозгового материала в защитной среде,лиофилизированном состоянии и не более 3 влажности, от минус 18 С до минус 86 С. Жизнеспособность замороженного вируса поддерживается путем пассажа на культуре клеток один раз в год, а лиофилизированного мозгового материала один раз в 5 лет, через мозг кролика. Пример 1. Пример селекционирования штамма вируса бешенстваКМИЭВ 94. Для получения заявляемого штамма использован штаммКМИЭВ 19. Штамм-антиген, последовательно пассирован через мозг мышей, а потом адаптирован в культуре клеток до 4-7 пассажей. В 5-7 пассажах титр вируса составил 6,0-7,550/мл. На основе указанного штамма приготовленная вакцина при приеме перорально вызывает образование антирабического иммунитета через 14-21 день и предохраняет от заражения против 10-1000 50 уличного вируса бешенства. Штаммом вируса-71 БелНИИЭВ-ВГНКИ с титром 4,45 заразили белых мышей интрацеребрально и после смерти мышей 10 стерильной взвеси извлеченной мозговой ткани заражали культуру клеток , ПС или ВНК 21. Через 4-5 дней культуру клеток замораживали, оттаивали и обратно заражали здоровых белых мышей и так несколько раз. Для этого содержимое 10-15 ампул (объем вируссодержащего материала в каждой ампуле 1 мл) растворяют в 10-15 мл рабочего раствора Хенкса или среде Игла и вносят по 1,0-1,5 мл в 8-10 флаконов вместимостью 250 мл с культурой клеток . После контакта вируса с клетками (60-90 мин при комнатной температуре) во флаконы вносят по 30 мл поддерживающей среды, в качестве которой используют среду Игла с добавлением 5 сыворотки крупного рогатого скота ( 7,4-7,6). Флаконы герметически закрывают пробками и инкубируют при температуре (37-0,5 С). После 3-4 суток культивирования проводят смену поддерживающей среды, а через 6 суток зараженную культуру клеток промораживают при минус 30 С и ниже не менее 14-16 ч. Культуральную вируссодержащую суспензию во флаконах размораживают при комнатной температуре, сливают в бутыль и тщательно перемешивают. Пример 2. Способ приготовления вакцины культуральной для пероральной иммунизации. Получения вируса для изготовления вакцины. При изготовлении производственных серий вакцины исходят из расчета, что каждая серия составляет 25-50 тысячи прививочных доз. Для этого необходимо получить 250500 матрасов вместимостью 1,5 л или 200-400 бутылей вместимостью 2,0 л культуры клеток , ПС или ВНК-21. Примерный расчет потребности компонентов для изготовления 25 тыс. доз или 50 л вакцины рабочий раствор Хенкса - 25 л раствор трипсина - 25 л питательная среда Игла - 100 л сыворотка крови крупного рогатого скота - 7 л 7,5 -ный раствор соды - 2,5 л гентамицин - 30,0 г посевной вирус - 1,5 л (стационарный метод), 2,0 мл (роллерный метод). Титр вируса 6,0-7,550/мл и выше. Предварительно выращивают культуру клеток и для заражения не более 24 часового роста, отбирают матрасы или бутыли с хорошо сформированным монослоем клеток без зернистости или спонтанной дегенерации. После удаления среды роста в каждый мат 5 13935 1 2010.12.30 рас и бутыли с культурой клеток вместимостью 2,0 л вносят посевного в количестве 0,1-0,6 50 на клетку и равномерным покачиванием распределяют его по поверхности монослоя. После контакта с клетками (60-90 мин при комнатной температуре) в матрасы добавляют поддерживающую среду в количестве 180-200 мл, в бутыли 200-250 мл -6,77,8. Вирус можно добавлять и вместе с поддерживающей средой без предварительного контакта. Инкубируют емкости при температуре 370,5 С в статичном положении (матрасы) или при вращении роллера в пределах 30-40 оборотов в час (бутыли) в течение 3-4 суток. Через 4 суток культивирования производят первый слив вируссодержащей среды, а через 6 суток повторный. Из каждого 20-го матраса (бутыли) делают высевы на бактериальную и микологическую стерильность (п. 4.7.8), после этого их помещают при температуре минус 20-40 С и сохраняют до проведения титрации вируса. Не ранее чем через 16-18 ч после замораживания 2-3 матраса или бутыли с зараженной культурой клеток оттаивают при комнатной температуре и содержимое их смешивают. Из полученной смеси берут пробу в количестве 5-10 мл для титрования вируса путем заражения мышей в мозг, а оставшуюся вируссодержащую жидкость на 80-90 мас.добавляют глицерин 10-20 мас. . Таким образом, использование заявляемого штамма фиксированного аттенуированного вируса бешенстваКМИЭВ 94, обладающего высоким титром - 6,0-7,5 М 50/мл (а в прототипе титр равен 4,5-6,0) при конструировании вакцины, обладающей высоким титром, и способ ее получения позволяет изготовить высокоиммуногенную сравнительно дешевую вакцину. Пример 3. Определение инфекционной активности вируса в вакцине (титр). Проведение испытания. Вакцину из двух флаконов смешивают и из смеси готовят десятикратные разведения от 10-1 до 10-8. Для этого в ряд из 8 пробирок наливают по 9,0 мл питательную среду. В первую пробирку вносят 1,0 мл вакцины. Чистой пипеткой перемешивают содержимое первой пробирки и 1,0 мл переносят во вторую пробирку и т.д. до конечного разведения 10-8. Каждым разведением вируса, начиная с разведения 10-8 в объеме 0,03 мл заражают в мозг не менее 4 мышей. Срок наблюдения за мышами 15 дней. Специфической считается гибель мышей не ранее чем на 5 сутки после заражения при наличии типичных признаков заболевания (параличи, парезы, коматозное состояние и др. и подтверждается методом РФА). Расчет титра вируса производят по методу Рида и Менча или Керберу в модификации Ашмарина. Таблица 1 Сравнительная характеристика предлагаемой вакцины и прототипа Состав вакцины и этапы полученияКМИЭВ 94 Штамм вируса Культура клеток Среда культивирования Посадочная концентрация клеток Время подращивания культуры Время культивирования Инфекционная активность 50/мл Иммуногенность. 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ ФЭК ПК Игла 0,3-0,4 млн. кл/мл 24-48 ч 6 суток 13935 1 2010.12.30 Пример 3. Определение контаминации бактериями и грибами вакцины. Сущность метода. Выделение микроорганизмов путем инкубирования питательной среды, в которую внесена вакцина. Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие определенных микроорганизмов. Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры. Компоненты питательных сред должны соответствовать ГФХ 1, вып. 2, С. 200-201. Состав и приготовление питательных сред. Среда 1 - для выращивания бактерий пептона ферментативного сухого ГОСТ 13805 10 г натрия хлорида ГОСТ 4233 5 г глюкозы ГОСТ 975 1 г агара микробиологического ГОСТ 17206 13 г мясной воды (12) ГФ 11, вып. 2. 1000 млпосле стерилизации 7,30,2. К мясной воде прибавляют пептон и натрия хлорид, растворяют при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают , кипятят в течение 1 мин, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 С в течение 15 мин. Среда 2 - для выращивания грибов (Сабуро) пептона ферментативного сухого 10 г глюкоза 40 г агара микробиологического 13 г мясной воды (12) 1000 млпосле стерилизации 5,60,2. Все ингредиенты растворяют в мясной воде, прибавляют замоченный заранее агар,нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 С в течение 15 мин. Для подавления роста бактерий после стерилизации насыщенным паром под давлением прибавляют 100 мг бензилпенициллина и 100 мг тетрациклина(либо перед стерилизацией насыщенным паром под давлением - 50 мг левомицетина) на 1000 мл среды. Проведение испытания. Для проверки вакцины на контаминацию бактериями и грибами вакцину из 2 флаконов объединяют. Образец вакцины высевают на питательные среды ГФ 1, вып. 2, С. 196-197. Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри диаметром 90-100 мм. Посевы просматривают ежедневно. Определение общего числа бактерий. Объединенная суспензия вакцины вносится по 1 см 3 в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры от 45 до 50 С среды 1. Быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды 1. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 сут. при температуре от 30 до 35 С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут. подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на два, вычисляют число бактерий в 2,0 см 3 вакцины. Определение общего числа грибов. Испытание проводят двуслойным агаровым методом, описанным выше, используя среду 2. Посевы инкубируют в течение 5 сут. при температуре от 20 до 25 С. Через 72 ч и окончательно через 5 сут. подсчитывают общее 7 13935 1 2010.12.30 число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находят среднее значение,умножая его на два и вычисляют число грибов в одной дозе вакцины. Источники информации 1. Кузнецов, П.П., Иванов и др. Передовой научно-производственый опыт биологической промышленности. Передовой научно-производственый опыт биологической промышленности, экспресс информация. - ., 1979. - Т. 3. - С. 3-8. 2. , ..- 32-32-107 .. . - , 1980. - . 64. 3. А.с. СССР 1091393 А, МПК 361 39/205 (прототип). 4. Методы лабораторных исследовании по бешенству. Третье издание. - ЖеневаИзд. ВОЗ, 1975. - С. 199. 5. А.с. СССР 1120701, МПК 3 С 12 7/00 (прототип). 6. А.с. СССР 1120701, МПК 3 С 12 7/00 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8