Способ определения меламина в пищевых продуктах, содержащих молоко или молочные продукты

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕЛАМИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ, СОДЕРЖАЩИХ МОЛОКО ИЛИ МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Шуляковская Ольга Васильевна Половинкин Леонид Васильевич Белышева Людмила Леонидовна Полянских Елена Ильинична(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(57) Способ определения меламина в пищевых продуктах, содержащих молоко или молочные продукты, включающий экстракцию меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане, очистку и концентрирование экстракта с последующим количественным определением содержания меламина в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет массовой доли меламина, отличающийся тем, что экстракцию меламина проводят смесью 5 -ного водного раствора трихлоруксусной кислоты и ацетонитрила в течение 10 мин при температуре 50 С в ультразвуковой бане, а очистку и концентрирование экстракта осуществляют с помощью твердофазной экстракции. Изобретение относится к медицине, к разделу лабораторной диагностики, а также к пищевой промышленности. Известен способ определения меламина в молоке и молочных продуктах, основанный на экстракции меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане и последующим количественным определением содержания меламина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 1. Способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является экстракция меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане с последующим количественным определением содержания меламина в экстракте с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако указанный способ не позволяет количественно определять меламин с высокой чувствительностью и точностью из-за низкой специфичности используемых растворителей. 17973 1 2014.02.28 Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности и точности определения. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ определения меламина в пищевых продуктах, содержащих молоко или молочные продукты, включающий экстракцию меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане, очистку и концентрирование экстракта с последующим количественным определением содержания меламина в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет массовой доли меламина, причем экстракцию меламина проводят смесью 5 -ного водного раствора трихлоруксусной кислоты и ацетонитрила в течение 10 мин при температуре 50 С в ультразвуковой бане, а очистку и концентрирование экстракта осуществляют с помощью твердофазной экстракции. Указанные условия экстракции, очистки и концентрирования позволяют достичь максимальной чувствительности (предел обнаружения меламина увеличивается в 5 раз) и извлечения меламина из пищевых продуктов, содержащих молоко или молочные продукты. Пример. Определение меламина в пищевых продуктах, содержащих молоко или молочные продукты. 1. Экстракция. Навеску исследуемого образца 10,000,01 г помещают в пробирку для центрифугирования вместимостью 50 см 3, добавляют 25,0 см 3 5 -ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 10 см 3 ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают и помещают на 10 мин в ультразвуковую баню при температуре 50 С. Затем пробирку центрифугируют 10 мин со скоростью 4000 об/мин. Отбирают верхний слой в отдельную пробирку, а к осадку добавляют еще 25,0 см 3 5 -ного раствора ТХУ и 7,5 см 3 ацетонитрила, встряхивают, помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Отбирают верхний слой и присоединяют к первой порции. К осадку в третий раз прибавляют 25 см 3 5 -ного раствора ТХУ и 7,5 см 3 ацетонитрила,встряхивают, помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Отбирают верхний слой и присоединяют к первой и второй порциям. Объединенный экстракт фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 см 3 через бумажный фильтр синяя лента, который необходимо предварительно смочить 1 см 3 5 -ного раствора ТХУ. Объем доводят до метки 5 -ным раствором ТХУ. 2. Очистка и концентрирование экстракта. Для проведения твердофазной экстракции отбирают 25 см 3 экстракта, полученного по п. 1, в пробирку вместимостью 50 см 3, добавляют 5 см 3 дистиллированной воды, раствор тщательно перемешивают. При содержании жира в образце более 10 перед проведением твердофазной экстракции проводят обезжиривание экстракта (п. 1). Берут 30 см 3 экстракта, помещают в делительную воронку на 100 см 3, добавляют 25 см 3 гексана, встряхивают в течение 1 мин и оставляют до полного разделения слоев. Затем отбирают 25 см 3 нижнего слоя в пробирку для проведения твердофазной экстракции, добавляют 5 см 3 дистиллированной воды, раствор тщательно перемешивают. Через подготовленный предварительно картридж пропускают 30 см 3 экстракта из пробирки (п. 2). Затем промывают картридж 5 см 3 дистиллированной воды, а затем 5 см 3 метанола. Высушивают картридж под вакуумом в течение 1-2 мин, а затем элюируют меламин 25 см 3 1,25 -ного раствора аммиака в метаноле со скоростью элюирования 0,5-1,0 см 3/мин. Полученный элюат упаривают досуха в этой же пробирке на роторном испарителе при температуре 50 С. Сухой остаток растворяют в 1 см 3 подвижной фазы, фильтруют через мембранный фильтрс размером пор 0,45 мкм. 2 17973 1 2014.02.28 Подготовка картриджа. Устанавливают картридж (3 /60 кат.5982-3236) в установку для твердофазной экстракции, включают насос, с помощью крана и секундомера устанавливают скорость элюирования метанола 0,5-1,0 см 3/мин. Через сорбент пропускают 5 см 3 метанола, а затем 6 см 3 дистиллированной воды. 3. Приготовление растворов. 3.1. Приготовление 1 М раствора . Взвешивают 4,000,01 г , помещают в мерную колбу вместимостью 100 см 3, добавляют 50 см 3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения щелочи,охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в склянке, закрытой притертой полимерной пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение одного года. 3.2. Приготовление 5,0 -ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В коническую колбу вместимостью 250 см 3 помещают 5,0000,001 г ТХУ и добавляют 95,0000,001 г дистиллированной воды, перемешивают. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 6 месяцев. 3.3. Приготовление 1,25 -ного раствора аммиака в метаноле. В коническую колбу вместимостью 250 см 3 помещают 5,0000,001 г аммиака водного и добавляют 95,0000,001 г метанола, перемешивают. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение одного месяца. 3.4. Приготовление подвижной фазы. В плоскодонный стакан вместимостью 1000 см 3 помещают 2,3430,001 г октансульфоната натрия и 1,9240,001 г лимонной кислоты, растворяют в 850 см 3 дистиллированной воды, с помощью 1 М растворадоводят до 3,0. Полученный раствор помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. К 920 см 3 полученного раствора добавляют 80 см 3 ацетонитрила. Подвижную фазу фильтруют через мембранный целлюлозный фильтр. Раствор хранят в склянке из темного стекла с завинчивающейся пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение одного месяца. 3.5. Приготовление стандартных растворов меламина. 3.5.1. Приготовление основного стандартного раствора меламина концентрацией 500 мкг/см 3. Навеску 0,1000 г 0,0001 г кристаллического меламина вносят в мерную колбу вместимостью 200 см 3, добавляют 100 см 3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на 15 мин при комнатной температуре, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Раствор стабилен в течение трех месяцев. 3.5.2. Приготовление стандартного раствора меламина концентрацией 100 мкг/см 3(раствор А). Отбирают 10,0 см 3 основного стандартного раствора меламина, приготовленного по п. 3.5.1, и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3, объем доводят до метки подвижной фазой. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Раствор стабилен в течение семи суток. 3.5.3. Приготовление стандартного раствора меламина концентрацией 10 мкг/см(раствор Б). Отбирают 10,0 см 3 стандартного раствора меламина (раствор А), приготовленного по п. 3.5.2, и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см 3, объем доводят до метки подвижной фазой. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Раствор стабилен в течение семи суток. 17973 1 2014.02.28 3.5.4. Приготовление градуировочных растворов меламина. Градуировочные растворы меламина концентрацией 0,2 мкг/см 3, 0,5 мкг/см 3, 1,0 мкг/см 3, 2,5 мкг/см 3, 5,0 мкг/см 3 готовят по схеме, представленной в табл. 1. Аликвотные части стандартных растворов А и Б меламина переносят в мерные колбы и доводят подвижной фазой до метки при 202 С. Таблица 1 Схема приготовления градуировочных растворов меламинаградуировочного раствора 1 2 3 4 5 Объем аликвотной части стандартного раствора меламина, см 3 5,0 (раствор А) 2,5 (раствор А) 5,0 (раствор Б) 5,0 (раствор Б) 2,0 (раствор Б) Градуировочные растворы хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Растворы стабильны в течение семи суток. 4. Установление градуировочной характеристики. Полученные по п. 3.5.4 градуировочные растворы меламина хроматографируют, начиная с самой низкой концентрации. Условия хроматографирования объем вводимой пробы 20 мкл скорость подачи подвижной фазы 1,5 см 3/мин температура термостата колонки 30 С длина волны 240 нм ширина оптической щели 16 нм ширина пика 0,1 мин 4 нм. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее двух раз, принимая за результат измерения среднее арифметическое параллельных измерений. 5. Построение градуировочного графика. Для построения градуировочного графика устанавливают зависимость площади пиков от соответствующей концентрации меламина в градуировочном растворе. Прямая градуировочного графика должна проходить через начало координат и определяться функциональной зависимостью,(1) где- площадь пика меламина- концентрация меламина в градуировочном растворе- коэффициент регрессии. Градуировочный график рассчитывается методом наименьших квадратов. 6. Выполнение измерений. Анализ полученного по п. 2 фильтрата проводят на жидкостном хроматографе. Условия хроматографирования такие же, как и при построении градуировочного графика п. 4. Определяют площади пиков, используя компьютерную систему обработки сигналов. Проводят анализ двух параллельных проб. 7. Обработка результатов измерений. Расчет содержания меламина,мг/кг, проводят по формуле 13 17973 1 2014.02.28 где- концентрация меламина, найденная по градуировочному графику, мкг/см 3- масса навески, г 1 - общий объем экстракта, 100 см 3 2 - объем экстракта, взятого для пропускания через картридж, 25 см 3 3 - объем подвижной фазы, взятый для растворения сухого остатка пробы после упаривания, 1 см 3. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений. Вычисления проводят до третьего знака после запятой и округляют до второго. Результаты определения меламина в пищевых продуктах, содержащих молоко или молочные продукты, представлены в табл. 2. Таблица 2 Определяемое содержания меламина в пищевых продуктах,содержащих молоко или молочные продуктах предлагаемым способом Время ТемпеОпредеПредел экстрак Внес ИзвлеНаименова- ратура ляемое обнаруции,к-во,чение,ние продукта экстраккол-во,жения,мин мг/кг 60 Плодоовощные консервы для детского питания,содержащие йогурт содержащие творог По предлагаемому способу 4,22 84,4 4,35 87,0 4,45 89,0 4,42 88,4 5 4,85 97,0 4,80 96,0 4,74 94,8 4,80 96,0 4,85 97,0 4,15 83,0 4,20 84,0 4,23 84,6 4,47 89,4 5 4,68 93,6 4,73 94,6 4,70 94,0 4,73 94,6 4,75 95,0 4,85 97,0 Смесь растворителей для экстракции 17973 1 2014.02.28 Достигаемый технический результат заявляемого способа заключается в том, что способ позволяет в 5 раз увеличить предел обнаружения (увеличение чувствительности метода), а также повышает точность определения на 2,9-18,3 . Источники информации 1. МУК 4.1.2420-08. Методические указания по определению меламина в молоке и молочных продуктах. - М., 2008 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6