Способ получения 9-?-D-арабинофуранозиладенина

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ерошевская Людмила Анатольевна Квач Сергей Вячеславович Зинченко Анатолий Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)6911341 2, 2005.3616208, 1971.59-13800 , 1984.54-89090 , 1979.9975 1, 2007.55-104894 , 1980.55-29941 , 1980. ЕРОШЕВСКАЯ Л.А. и др. Микробиология и биотехнологиястолетия Материалы международной конференции. - Минск, 2002. - С. 175-176.(57) Способ получения 9 арабинофуранозиладенина, включающий инкубирование при температуре 60 С эквимолярных количеств аденина и урациларабинозида в фосфатном буфере с рН 7,0 в присутствии уридинфосфорилазы и пуриннуклеозидфосфорилазыи выделение целевого продукта, отличающийся тем, что используют 0,2-0,3 М -фосфатный буфер, аденин и урациларабинозид вносят в реакционную смесь в количестве 450-550 ммоль/л каждого, концентрация уридинфосфорилазы в реакционной смеси составляет 400 е.а./мл, а пуриннуклеозидфосфорилазы - 2000 е.а./мл. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам получения 9 арабинофуранозиладенина (синонимы ара-А, видарабин, аденинарабинозид) - модифицированного нуклеозида, который обладает широкой активностью в отношении ДНК-содержащих вирусов, в том числе вируса герпеса, вызывающего энцефалиты,кератиты и др. заболевания человека 1-5, и может быть использован для получения активной субстанции при производстве соответствующих лекарственных препаратов. Химические методы синтеза ара-А характеризуются многостадийностью и низкими выходами 6, 7. Получение ара-А путем ферментации - культивирования микроорганизма 3238 - также малоэффективно 8. Известен способ получения ара-А 9, заключающийся в замене урацила в молекуле 1 арабинофуранозилурацила (ара-У) на аденин при последовательном действии двух иммобилизованных бактериальных ферментов - уридинфосфорилазы (УРФ) и пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ), изолированных из. Исходные ара-У и аденин берутся в концентрациях соответственно 5 и 6 мМ. Процесс ведут при 60 С в 5 мМ фос 14024 1 2011.02.28 фатном буфере (рН 7,0). Выход ара-А на затраченный ара-У составляет 56 , что приводит к расходу ара-У в количестве 1,6 г на 1 г полученного ара-А. Волуметрический выход ара-А (выражающийся в количестве целевого продукта, получаемого с единицы объема реакционной смеси) составляет 0,75 г/л. Недостатки способа состоят в следующем 1) относительно невысокий выход целевого продукта в расчете на ара-У, приводящий к значительному расходу дорогостоящего модифицированного нуклеозида 2) незначительный волуметрический выход ара-А, обуславливающий низкую эффективность использования единицы объема биореактора. Известен способ получения ара-А 10, заключающийся в том, что смесь ара-У и аденина, взятых в концентрации по 75 мМ, инкубируют в фосфатном буфере с УРФ и ПНФ. Степень биоконверсии ара-У в ара-А составляет 70 . Волуметрический выход целевого продукта до выделения его из реакционной смеси составляет 14 г/л. Недостатками способа являются невысокая степень конверсии ара-У в целевой продукт (70 ) и низкий (14 г/л) волуметрический выход целевого продукта. Информация о процедуре и результатах выделения ара-А из реакционной смеси в источнике не приведена, что затрудняет выбор данного аналога в качестве прототипа. Из известных способов получения ара-А наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ара-А 11(прототип) из ара-У и аденина под действием смеси УРФ и ПНФ. Исходные субстраты - ара-У и аденин - берут в эквимолярных концентрациях, составляющих 74,6 мМ. Процесс ведут при 60 С в 30 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). Степень биоконверсии достигает 70 . После выделения целевого продукта из реакционной смеси кристаллизации получают ара- с выходом 65 . Недостатками способа являются 1) относительно низкий выход ара-А (65 ), что приводит к высокому расходу дорогостоящего ара-У, составляющему 1,42 г на получение 1 г целевого продукта 2) сравнительно невысокий волуметрический выход ара-А, составляющий 12,8 г/л реакционной смеси, что обуславливает низкую эффективность использования единицы объема биореактора. Высокий расход дорогостоящего сырья и низкий волуметрический выход целевого продукта ограничивает возможность применения рассматриваемого способа в условиях промышленного производства. В основу всех известных способов ферментативного получения ара-А положена обратимая реакция трансгликозилирования, что затрудняет достижение высоких выходов целевого продукта. В некоторых известных способах 12-14 для повышения выхода ара-А в реакционную смесь вносят избыточное (обычно 3-кратное) количество сравнительно хорошо растворимого ара-У. Это способствует сдвигу равновесия процесса в сторону прямой реакции, однако приводит к значительному расходу исходного нуклеозида, стоимость которого в десятки раз превышает стоимость аденина. Кроме того, известные способы характеризуются низкими волуметрическими выходами ара-А. Этот недостаток обусловлен тем, что процесс ведут при низких концентрациях исходных реагентов. Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода ара-А в расчете на затраченный ара-У и повышение волуметрического выхода целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что смесь ара-У (донор арабинозного остатка) и аденина (акцептор) в эквимолярных количествах, составляющих 450-550 ммоль/литр каждого, инкубируется в 0,2-0,3-фосфатном буфере (рН 7,0) при 60 С с УРФ и ПНФ,изолированных из. Целевой продукт выделяют из реакционной смеси известными приемами 11. 14024 1 2011.02.28 Процесс ведут в фосфатном буфере в связи с тем, что фермент УРФ, действие которого необходимо для расщепления молекулы ара-У на урацил и арабинозо-1-фосфат, проявляет свою активность только в присутствии ионов неорганического фосфата. Температура (60 С) и величина рН (7,0) реакционной смеси совпадают с указанными в способе-прототипе и, согласно литературным данным 9, 12-14, обеспечивают максимальную активность использующихся ферментов. Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции 2 На первой стадии процесса УРФ с участием фосфат-ионов расщепляет ара-У на урацил и арабинозо-1-фосфат. На второй стадии ПНФ из арабинозо-1-фосфата и аденина синтезирует ара-А с освобождением неорганического фосфата. В отличие от известных способов получения ара-А из аденина и ара-У, в предлагаемом техническом решении в реакционную смесь вносятся такие большие количества исходных субстратов (в среднем по 500 нмолей/л), которые ранее не применялись. Существенно (с 30 до 200-300 мМ) повышена также экспериментально подобранная концентрация -фосфатного буфера. Следует отметить, что в начале процесса в растворенном состоянии находится весь ара-У и приблизительно одна десятая часть аденина. По мере синтеза ара-А концентрация растворенного аденина снижается, что вызывает постепенное растворение аденина, находящегося в осадке. Указанные отличия являются существенными, поскольку только при применении этих параметров процесса удается достичь цели изобретения - повышения выхода ара-А в расчете на затраченный ара-У и повышения волуметрического выхода целевого продукта. По мнению авторов, положительный эффект обусловлен следующими причинами. Во-первых, в ходе протекания первой стадии процесса после достижения урацилом в реакционной среде концентрации 89 мМ (концентрация насыщенного раствора) он начинает выпадать в осадок, что по закону действующих масс сдвигает равновесие реакции в сторону более глубокого фосфоролиза ара-У, тем самым приводя к большему накоплению в среде арабинозо-1-фосфата - субстрата для заключительной стадии синтеза ара-А. При недостаточно высоких концентрациях исходного ара-У этот эффект наблюдаться не может. Во-вторых, по мере протекания второй стадии процесса образующийся ара-А после достижения им концентрации 11,2 мМ (концентрация насыщенного раствора) также начинает выпадать в осадок, что закономерно благоприятствует синтезу большего количества этого продукта. При этом, чем большее количество ара-А будет выведено из сферы обратимой реакции, тем, в конечном счете, более высокий выход целевого продукта будет достигнут. Иными словами, вклад этого эффекта (выпадение ара-А в ходе процесса в осадок) в повышение выхода целевого продукта тем весомее, чем более высокие концентрации субстратов берутся в реакцию. Высокий выход целевого продукта, при условии больших количеств взятых в реакцию субстратов, автоматически обеспечивает достижение его высокого волуметрического выхода. 3 14024 1 2011.02.28 Следует отметить, что использование ара-У и аденина в концентрациях больших, чем в предлагаемом способе, нерационально, так как приводит к значительным техническим трудностям, связанным с перемешиванием реакционной смеси, содержащей большое количество выпавших в осадок ара-А и урацила. Используемые высокие концентрации -фосфатного буфера найдены экспериментальным путем, поскольку влияние этого параметра на эффективность процесса неоднозначно. С одной стороны, повышение концентрации ионов фосфата благоприятствует фосфоролизу ара-У, приводящему к образованию промежуточного продукта (арабинозо-1-фосфата),необходимого для синтеза ара-. С другой стороны, фосфат-ионы способствуют фосфоролитическому разложению самого образующегося целевого продукта. По мнению авторов, только сочетание указанных выше признаков способа (повышение количества вносимых в реакционную смесь аденина и ара-У с 74,6 до 450-550 ммоль/л в сочетании с повышением концентрации -фосфатного буфера с 30 до 200-300 мМ) приводит к решению поставленной задачи. Это сочетание признаков является новым, так как не встречается в общедоступной патентной и научно-технической литературе, и отвечает критерию технический уровень, поскольку не является очевидным для специалистов. Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления. Пример 1 Получение ара-А в оптимальных условиях проведения процесса. Реакционную смесь (0,1 л), содержащую 6,755 г аденина (50 ммоль), 12,210 г ара-У(200000 ед. активности), изолированные из клетокБМ-11, согласно известному методу 15, инкубировали при 60 С с перемешиванием. За приростом количества целевого продукта в смеси следили с помощью тонкослойной хроматографии. После прекращения прироста ара-А в реакционной смеси (продолжительность процесса 17 ч степень конверсии ара-У в целевой продукт 96 ) ее развели в 10 раз горячей дистиллированной водой, выдержали 30 мин на кипящей водяной бане до полного растворения ара-А и после доведения рН до 9,0 поместили на холод (бытовой холодильник) на 24 ч. Сформировавшийся осадок собрали на стеклянном фильтре под вакуумом, промыли 50 мл охлажденной дистиллированной воды и после перекристаллизации из воды высушили в суховоздушном сушильном шкафу при температуре 60 С в течение 5 ч. Получили 12,135 г препарата ара-А с содержанием основного вещества 98(44,5 ммоль), что соответствует 89 -ному выходу в расчете на взятый в реакцию ара-У. Волуметрический выход целевого продукта составил 118,9 г/л реакционной смеси. При хроматографировании на тонкослойных пластинках -254 фирмы(Германия) в системе растворителей изо-пропанол 25 -ный водный аммиак(72 об/об) подвижность целевого продукта совпадала сконтрольного препарата ара-А.. пл. целевого продукта 257-260 С. УФ-спектр (рН 1), макс нм 257 (15200) (рН 7), макс нм 259 (14500) (рН 13),макс нм 260 (15400). Элементный анализ для 101354,267 найденоС 45,045,0126,15 вычислено С 44,944,9026,21. ЯМР (ДМСО 6), , м.д. от 8,15 (1 , с, Н-8) 8,09 (1 , с, Н-2) 7,18 (2 ,с, 2) 6,21 (1 , д, -1, 124,5 Гц) 5,57 (1 , д, ОН-3, ,35,5 Гц) 5,48 (1 ,д, ОН-2, ,24,0 Гц) 4,09 (2 , м, 2, 3) 3,72 (1 , м, Н-4) 3,63 (2 , м, Н-5, Н-5). Пример 2 Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс вели в 0,20 К-фосфатном буфере при концентрациях аденина и ара-У в исходной реакционной смеси, равных 450 мМ. 4 14024 1 2011.02.28 После выделения из реакционной смеси получили 10,1 г (37,8 ммоль) ара-А, что соответствует 84 -ному выходу в расчете на взятый в реакцию ара-У. Волуметрический выход целевого продукта составил 101,0 г/л реакционной смеси. Пример 3 Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс вели в 0,30 К-фосфатном буфере при концентрациях аденина и ара-У в исходной реакционной смеси, равных 550 мМ. После выделения из реакционной смеси получили 12,0 г (45,1 ммоль) ара-А, что соответствует 82 -ному выходу в расчете на взятый в реакцию ара-У. Волуметрический выход целевого продукта составил 120,5 г/л реакционной смеси. Пример 4 Получение ара-А при использовании УРФ и ПНФ, продуцируемых другими штаммами. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что объем реакционной смеси составлял 10 мл и в качестве биокатализаторов использовали УРФ и ПНФ, изолированные из клеток различных штаммов. Достигнутые выходы реакции синтеза ара-А (без выделения целевого продукта) представлены в таблице. Сравнительная оценка эффективности использования УРФ и ПНФ различных штаммовдля получения ара-А Штамм бактерий Выход реакции синтеза ара-А,95,5 96,0 96,2 96,3 95,9 95,0 94,3 96,0 96,1 93,5 Из данных таблицы следует, что в предлагаемом техническом решении могут быть использованы УРФ и ПНФ, изолированные из различных штаммов бактерии. Представленные материалы свидетельствуют о том, что использование предлагаемого способа получения ара-А обеспечивает по сравнению с известным способом-прототипом следующие преимущества увеличение выхода целевого продукта в расчете на исходный модифицированный нуклеозид (ара-У) с 65 до 82-89 повышение волуметрического выхода целевого продукта с 12,8 до 101,2-120,5 г/л реакционной смеси. Таким образом, расходы ара-У на получение 1 г целевого продукта снижаются с 1,42 до 1,03-1,11 г и существенно повышается эффективность использования единицы объема биореактора. Предлагаемый метод высокотехнологичен и может быть успешно применен в условиях производства. 14024 1 2011.02.28 Источники информации 1.С 9 //,2.(. ).. -. - 1979. . 85-108. 2.,-.,,,.,.,, .// . . . . - 1981. - . 304. - . 313-318. 3. Новые подходы к химиотерапии герпесвирусных инфекций / Н.П.Чижов, Г.И.Головина, Т.И.Юрлова, Т.С.Брязжикова//Антибиотики и химиотерапия. - 1993. - . 38.10-11. - . 75-82. 4..,Т.,,12-//. - 2006. . 72,2. - . 157-161. 5..,,.,.,.,. 5,// . - 2009. - . 28,1. - . 43-55. 6..9 //. - 1975. -. 16,13. - . 1185-1188. 7.,//. 1978. - . 1. - . - 67-72. 8.1159290 .9-./., заявл. 29.12.1967 опубл. 23.07.1969. 9. Константинова И.Д., Леонтьева .А., Галегов Г.А., Рыжова О.И., Чувиковский Д.В.,Антонов К.В., Есипов .С., Таран С.А., Веревкина К.Н., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Биотехнологический способ получения рибавирина. Действие рибавирина и некоторых его комбинаций на репродукцию вируса осповакцины ( ) // Биоорганическая химия. - 2004. - . 30,6. - С. 613-620. 10..,.,.,.,.,.,.// , ,. - 2001. - . 20,(4-7). - . 977-979. 11.6911341 ./. , . , . . . , . ,. , заявл. 25.06.2002 опубл. 28.06.2005 (прототип). 12. Ерошевская Л.А., Барай В.Н., Зинченко А.И., Квасюк .И., Михайлопуло И.А. Препаративный синтез противовирусного нуклеозида 9 аденинарабинозида с помощью бактериальных клеток // Антибиотики мед. биотехнол. - 1986. - . 31,3. - С. 174-178. 13.М.С.,,.,,21// . . 2002. - . 20,5. - . 347-351. 14.,,.,,.,//.. . . - 2008. - . 9,7. - . 520-526. 15. Бокуць С.Б., Барай У, Дудчык Н.У., Знчанка Метад комплекснага выдзяленняачыстк нуклеаздфасфарылаз// Весц АН Беларус, сер. бял. навук. - 1994. -4. - С. 45-50. ациональный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6