Способ получения 9-((-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ерошевская Людмила Анатольевна Барай Владимир Николаевич Калиниченко Елена Николаевна Михайлопуло Игорь Александрович Зинченко Анатолий Иванович(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения 9-(арабинофуранозил)-2-фтораденина, заключающийся в том,что готовят реакционную смесь, содержащую в 0,03-0,05 М фосфатном буфере 55-65 мМ 2-фтораденина, 110-130 мМ урациларабинозида и 2-2,5 мас.клетокБМ 21, и инкубируют ее при рН 6,8-7,2 и температуре 58-62 С в течение 4 суток с последующим выделением целевого продукта. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам получения 9-(арабинофуранозил)-2-фтораденина (2-фтор-ара-А) - модифицированного нуклеозида, который в фосфорилированной форме (в виде 5-монофосфата) применяется для терапии ряда онкогематологических заболеваний 1-3 и может быть использован для получения активной субстанции при производстве соответствующих лекарственных препаратов. Известен химический способ получения 2-фтор-ара-А соединением 2,6-дихлорпурина(азотистое основание) с 2,3,5-три-О-бензил-В-арабинозилхлоридом (донор арабинофуранозы) в 9-(2,3,5-три-О-бензиларабинофуранозил)-2,6-дихлорпурин с последующей трансформацией в 2 стадии в 9-(2,3,5-три-О-бензиларабинофуранозил)-2,6-диаминопурин и далее реакцией Шиманна в соответствующий 2-фтор-6-амино-арабинофура 9975 1 2007.12.30 нозилпурин. Удаление О-бензильных групп приводит к 2-фтор-ара-А с суммарным выходом 4,64. Недостатками указанного способа получения 2-фтор-ара-А являются трудоемкость процесса и низкий выход целевого продукта. Наиболее близким к заявляемому является способ получения 2-фтор-ара-А 5 (прототип) соединением 2,6-диаминопурина с 2,3,5-три-О-бензиларабинозилхлоридом в 9-(2,3,5-три-О-бензиларабинофуранозил)-2,6-диаминопурин и далее реакцией Шиманна в соответствующий 2-фтор-6-амино-арабинофуранозилпурин. Удаление О-бензильных групп приводит к 2-фтор-ара-А с выходом 17,5 . В этом способе модифицированы две заключительные стадии предыдущего способа-аналога 4, что позволило увеличить выход вдвое, однако, из-за низкого выхода при соединении 2,6-диаминопурина с 2,3,5-триО-бензиларабинозилхлоридом (азотистого основания с донором арабинозы) (40 ) суммарный выход не превышает 17,5 . Недостатками способа-прототипа получения 2-фтор-ара-А являются многостадийность и трудоемкость процесса, а также низкий выход целевого продукта, что обусловлено недостаточной специфичностью химической стадии арабинозилирования (соединения использованных азотистых оснований с донором арабинофуранозы), приводящей к образованию побочных продуктов. Задачей предполагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса его получения. Поставленная задача решается путем воздействия биокатализатора в виде бактериальных клеток на смесь 2-фтораденина (азотистое основание) и урациларабинозида (донор арабинофуранозы) в 0,03-0,05 М фосфатном буфере ( 6,8-7,2) при 58-62 С в течение 4 суток, причем концентрация 2-фтораденина в исходной смеси составляет 55-65 мМ, а урациларабинозида - 110-130 мМ. В качестве бактериальных клеток используют клеткиБМ-21 в концентрации 2-2,5 мас. . Целевой продукт выделяют из реакционной смеси известными приемами. Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции 2-Фтораденин ШтаммБМ-21 депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ В-200 Д. 2 9975 1 2007.12.30 Процесс ведут в фосфатном буфере ( 6,8-7,2) в связи с тем, что присутствующий в бактериальных клетках фермент - уридинфосфорилаза, действие которого необходимо для замещения урацила в молекуле ара-У на 2-фтораденин с образованием 2-фтор-ара-А, проявляет свою активность только в присутствии ионов неорганического фосфата. Таким образом, поставленная задача решается путем замены химической стадии арабинозилирования азотистого основания на ферментативную (причем в качестве исходного азотистого основания берется 2-фтораденин). Следует отметить, что ферментативные способы получения 2-фтор-ара-А в литературе не описаны, а возможность использования бактериальных клеток, в т.ч. клетокБМ-21, для синтеза 2-фтор-ара-А из неприродного субстрата - 2-фтораденина - не является очевидной. По мнению авторов, только сочетание указанных выше признаков способа приводит к решению поставленной задачи. Это сочетание признаков является новым, так как не является очевидным для специалистов и не встречается в общедоступной патентной и научнотехнической литературе. Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления. Пример 1. Получение 2-фтор-ара-А в оптимальных условиях проведения процесса. Реакционную смесь (1 л), содержащую 9,19 г 2-фтораденина (60,0 ммоль), 29,3 г ара-У(120,0 ммоль), 0,04 М К-фосфатный буфер ( 7,0) и 2,25 мас.(в расчете на сухую массу) клеток Е.БМ-21, инкубируют 4 суток при 60 С с перемешиванием. За приростом количества целевого продукта в смеси следят с помощью тонкослойной хроматографии. После прекращения прироста 2-фтор-ара-А в реакционной смеси ее для растворения целевого продукта разводят в 3 раза горячей дистиллированной водой, добавляют для коагуляции клеток 1 М раствор 2 до конечной концентрации 15 мМ и полученную суспензию подвергают горячему фильтрованию через бумажный фильтр. В фильтрат вносят 70 мл 0,5 М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты и помещают его на холод (бытовой холодильник) на 24 ч. Сформировавшийся осадок собирают на стеклянном фильтре под вакуумом, промывают 50 мл охлажденной дистиллированной воды и высушивают в суховоздушном сушильном шкафу при температуре 60 С в течение 5 ч. Получают 13,69 г (48 ммоль) 2-фтор-ара-А, что соответствует 80 -ому выходу в расчете на взятый в реакцию 2-фтораденин. При хроматографировании на тонкослойных пластинках -254 фирмы(Германия) в системе растворителей изопропанол 25 -ный водный аммиак (72 об/об) подвижность целевого продукта совпадала сконтрольного препарата 2-фторара-А. Т. пл. целевого продукта 259-260 С. УФ-спектр ( 1), макс нм 262 (13200) ( 7 и 13), макс нм 261 (15300). ЯМР 3,7(м, Н 4 и 2 Н 5), 4,15 (м, Н 2 и Н 3), 5,1 (т, 5-ОН), 5,55 и 5,65 (2 д, 2-ОН и 3-ОН),6,14 (д,12 3 , Н 1), 7,8 (уш. с, 2), 8,2 (с, Н 8). Пример 2. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс ведут при 58 С и концентрациях 2-фтораденина и ара-У в исходной реакционной смеси, равных 55 и 110 мМ соответственно. После выделения из реакционной смеси получают 12,87 г (75,2 мол. ) 2-фтор-ара-А. Пример 3. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс ведут при 62 С и концентрациях 2-фтораденина и ара-У в исходной реакционной смеси, равных 65 и 130 мМ, соответственно. После выделения из реакционной смеси получают 12,83 г (75,0 мол. ) 2-фтор-ара-А. 3 9975 1 2007.12.30 Пример 4. Получение фтор-ара-А при использовании клеток различных бактерий. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что в качестве биокатализатора используют клетки различных штаммов бактерий. Достигнутые выходы реакции синтеза 2-фтор-ара-А (без выделения целевого продукта) представлены в табл. 1. Из данных табл. 1 следует, что эффективность штаммаБМ-21 намного выше эффективности любого из проверенных штаммов бактерий. Таблица 1 Сравнительная оценка эффективности использования клеток различных штаммов бактерий в качестве биокатализатора Выход фтор-ара-А,Относительная Штамм бактерий мол.эффективность,БМ-21 92 100 Е. со БМТ-1 Д/1 А 60 65 БИМ В-245 54 59 Е.-600 50 54 Е.НВ-101 51 55 Е. со ЦМПМ В-2039 43 47 Е.ЦМПМ В-2035 28 30-1216 28 30.ЦМПМ В-2927 27 29 Пример 5. Получение 2-фтор-ара-А при использовании различных концентраций клеток бактерий в реакционной смеси. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что процесс ведут при различных концентрациях бактериальных клеток в реакционной смеси. Достигнутые выходы целевого продукта представлены в табл. 2. Таблица 2 Влияние концентрации клеток бактерий в реакционной среде на выход целевого продукта Концентрация клеток бактеПродолжительность Выход фтор-ара-А, мол.рий в реакционной среде,процесса, сут. 1,0 50 10 2,0 77 5 2,25 80 4 2,5 80 3,5 Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о том, что оптимальной является концентрация клеток бактерий, находящаяся в пределах 2-2,5 , и дальнейшее ее повышение нерационально. С другой стороны, снижение концентрации клеток бактерий приводит к значительному снижению выхода продукта и в несколько раз замедляет процесс. Представленные материалы свидетельствуют о том, что использование предлагаемого способа получения 2-фтор-ара-А обеспечивает по сравнению с известным химическим способом преимущество в виде увеличения выхода целевого продукта в расчете на исходное азотистое основание с 17,5 до 75-80 мол.и упрощения процесса. 9975 1 2007.12.30 Источники информации 1. Пивник А.В., Кременецкая , Яхнина Е.И., Романова М.И., Воробьев А.И. Первый опыт лечения зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний аналогами пурина // Проблемы гематологии и переливания крови. - 1996. -2. - С. 55-62. 2.4357324 .92- / Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5