Способ получения поли-5′-фторуридиловой кислоты

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Титович Ольга Иринеушевна Ерошевская Людмила Анатольевна Зинченко Анатолий Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения поли-5-фторуридиловой кислоты, заключающийся в том, что реакционную смесь, содержащую в 0,2 М Трис-Н-буфере 2,0 ммоля 5-фтор-уридин-5 дифосфата и 7,5 ед. изолированной из бактериальных клеток полинуклеотидфосфорилазы,инкубируют при рН 8,5 и температуре 50 С до прекращения накопления целевого продукта, после чего в смесь вносят 12 ммоль уридина и клеткиБИМ В-200 Д в количестве, эквивалентном 160 ед. уридинфосфорилазы, и продолжают инкубировать до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением. 10279 1 2008.02.28 Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам получения 5-фторуридиловой кислоты поли-(5-фтор-У) - полимера, общей формулы(5-фторуридин-5-монофосфата) и применяющегося для химиотерапии злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта, мозга, кожи, яичников и др. органов 1, 2. Известен химический способ получения поли-(5-фтор-У) 3 с использованием твердофазного ДНК-синтезатора фирмы(модель 380 В) из 5-фторуридина с защищенными 2-, 3- и 5- гидроксильными группами. Недостатками указанного химического способа получения поли-(5-фтор-У) являются многостадийность, трудоемкость и длительность процесса, а также необходимость использовать сложную, дорогостоящую аппаратуру и токсичные растворители (безводные метанол, пиридин, тетрагидрофуран). Из известных способов получения поли-(5-фтор-У) наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности и достигаемому эффекту является ферментативный способ получения поли-(5-фтор-У) 4 (прототип), предусматривающий инкубацию 5-фторуридин-5-дифосфата (5-фтор-УДФ) с полинуклеотидфосфорилазойпри 30 С в присутствии 0,1 М Трис-НС-буфера (рН 8,2) и 2 мМ 2. Выход целевого продукта в реакции синтеза составляет 25 мол.в расчете на взятый в реакцию 5-фтор-УДФ. Недостатком способа-прототипа получения поли-(5-фтор-У) является низкий выход целевого продукта. Это обусловлено, главным образом, обратимостью протекающей реакции фермент катализирует не только прямую, но и обратную реакцию, т.е. фосфоролиз целевого продукта с образованием исходного 5-фтор-УДФ. Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта. Поставленная задача решается за счет того, что 5-фтор-УДФ инкубируют с бактериальной полинуклеотидфосфорилазой до достижения реакцией состояния равновесия, затем в реакционную смесь вносят уридин и клеткиБМ-21 и реакционную 2 10279 1 2008.02.28 смесь продолжают инкубировать до момента достижения максимального выхода целевого продукта. При этом в качестве полинуклеотидфосфорилазы используют фермент преимущественно Е.илиБИМ В-245. Целевой продукт выделяют из реакционной смеси известными приемами. Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции полинуклеотидфосфорилаза 5-Фтор-УДФ Проводят инкубацию 5-фтор-УДФ с полинуклеотидфосфорилазой. При этом происходит полимеризация 5-фтор-УДФ, сопровождающаяся образованием целевого продукта поли-(5-фтор-У) и побочного продукта - неорганического фосфата (Фн) (схема). Поскольку реакция обратима, через некоторое время она достигает состояния равновесия, характеризующегося прекращением накопления целевого продукта в среде. В этот момент в реакционную смесь вводят уридин и клетки Е. , проявляющие уридинфосфорилазную активность, и смесь продолжают инкубировать до достижения максимального выхода целевого продукта. В результате протекания известной реакции фосфоролиза уридина под действием уридинфосфорилазы в составе клеток Е.БМ-21 5 неорганический фосфат (Фн), образовавшийся в результате прямой реакции в виде побочного продукта, трансформируется в рибозо-1-фосфат, становясь, таким образом, недоступным для полинуклеотидфосфорилазы,т.е. теряет возможность участвовать в обратной реакции - фосфоролизе целевого продукта. Кроме того, удаление из реакционной среды неорганического фосфата по закону действующих масс приводит к сдвигу равновесия процесса в сторону образования дополнительного количества целевого продукта. Все это, в конечном счете, находит свое выражение в достижении 75 -ного выхода поли-(5-фтор-У) (рисунок в примере 1). На стадии синтеза поли-(5-фтор-У) используют полинуклеотидфосфорилазу, изолированную преимущественно из клеток Е. , и(таблица в примере 2),на стадии фосфоролиза уридина - клетки Е.БМ-21. Штамм Е.БМ-21 депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ В-200 Д. По мнению авторов, приводящее к решению поставленной задачи сочетание указанных выше двух ферментативных реакций является новым, так как не является очевидным для специалистов и не встречается в общедоступной патентной и научно-технической литературе. Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления. Пример 1 Получение поли-(5-фтор-У) в оптимальных условиях проведения процесса. Реакционную смесь (0,1 л), содержащую 0,94 г 5-фтор-УДФ (2,0 ммоль), 0,2 М ТрисНС-буфер (рН 8,5), 10 мМ 2, 2 мМ ЭДТА и 7,5 ед. полинуклеотидфосфорилазы (изо 3 10279 1 2008.02.28 лированных из клетокБИМ В-245), инкубируют при 50 С. За приростом количества целевого продукта в смеси следят с помощью тонкослойной хроматографии на тонкослойных пластинках -254 фирмы(Германия) в системе растворителей диоксан - изо-пропанол - вода - 25 -ный аммиак (4241 об/об). Спустя 10 ч к реакционной смеси добавляют 2,93 г уридина (12 ммоль) и клетки Е.БМ-21 (160 ед. уридинфосфорилазы), после чего смесь продолжают инкубировать в течение 11 ч. Динамику накопления целевого продукта в реакционной смеси отражает фигура. Стрелкой указан момент внесения в реакционную смесь уридина и клеток Е. . По окончании реакции к реакционной смеси добавляют 2 объема хлороформа и интенсивно встряхивают при комнатной температуре в течение 10 мин. После центрифугирования смеси (5000 , 5 мин) отбирают водную фазу. Из нее осаждают целевой продукт одним объемом этанола. Осадок формируют 16 ч при комнатной температуре, последовательно промывают 60 -ным и 96 -ным этанолом и высушивают при комнатной температуре в течение 6 ч. Получают 0,48 г хроматографически чистого поли-(5-фтор-У), что соответствует 69 -ному молярному выходу в расчете на взятый в реакцию 5-фтор-УДФ. УФ-спектр поглощения целевого продукта(рН 7), макс нм 267 (6500) совпал со спектром поли-(5-фтор-У), описанным в литературе 6. Элементный состав для (91028)мономера 324,1565. Вычислено,С 33,35 Н 3,098,655,86. Найдено,С 33,26 Н 3,108,345,80. Величина молекулярной массы продукта, определенная с помощью гель-фильтрации на колонках со смолой-60 и -65, находилась в пределах 300-1000 кДа. Пример 2 Получение поли-(5-фтор-У) при использовании полинуклеотидфосфорилаз из различных микроорганизмов. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что в качестве биокатализатора используют полинуклеотидфосфорилазы, изолированные из клеток различных микроорганизмов. Достигнутые выходы реакции синтеза поли-(5-фтор-У)(без выделения целевого продукта) представлены в таблице. Выход реакций синтеза поли-(5-фтор-У), катализируемых полинуклеотидфосфорилазой,изолированной из наиболее активных из 42 проверенных штаммов бактерий Выход реакций синтеза Относительная Микроорганизм поли-(5-фтор-У), мол.эффективность,БИМ В-245 75,0 100-600 74,9 100(продукт фирмы 10279 1 2008.02.28 Из данных таблицы следует, что, хотя эффективность применения полинуклеотидфосфорилазы, изолированной из бактерий Е.-600 иБИМ В-245, несколько выше эффективности этого фермента, изолированного из других микроорганизмов, тем не менее задача заявляемого изобретения решается с использованием любого из приведенных в таблице бактериальных штаммов. Представленные материалы свидетельствуют о том, что использование предлагаемого способа получения поли-(5-фтор-У) обеспечивает по сравнению с известным способом преимущество в виде увеличения выхода целевого продукта в расчете на исходный 5-фтор-УДФ с 25 до 69 мол. . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5