Штамм Escherichia coli КМИЭВ-39А – штамм-антиген

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Ломако Юрий Васильевич Андросик Николай Николаевич Карпович Валентина Константиновна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(56) Ломако Ю.В. Ветеринарная наука - производству. Научные труды. Вып. 36. Мн. Хата, 2002. - С. 91-95. Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных Автореф. дис. - М., 2002. - С. 6-43.2222591 2, 2004.2232189 1, 2004. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к биотехнологии,и касается штамма, выделенного от телят, больных колибактериозом, обладающего антигенной активностью, и может быть использовано для конструирования диагностических и профилактических препаратов при данном заболевании. Известно, что традиционные штаммы бактерий виданаселяют желудочно-кишечный тракт животных и человека 1, 2. Известны штаммы 1577 (или Н), продуцирующие веротоксин и вызывающие у человека диарею, геморрагический колит до гемолитико-уремического синдрома (ГУС), диарею и дизентерийно-подобную инфекцию у телят, отечную болезнь свиней 3. Известны доминирующие микроорганизмы при острых желудочно-кишечных заболеваниях телят, выделяемые из патологического материала от больных и павших телят в хозяйствах Республики Беларусь 4. Все штаммыобладают идентичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. Вместе с тем проявляют вариабельность в чувствительности к антибиотикам, вирулентности, иммуногенности. Эти бактерии растут на всех простых питательных средах. На мясо-пептонном агаре кишечная палочка образует сочные серо-белые колонии, а при росте на бульоне дает интенсивное помутнение, с образованием на дне обильного серо-белого осадка. На среде Эндо бактерии образуют колонии красного цвета с металлическим блеском с более интенсивно окрашенным центром. 10886 1 2008.08.30 Штаммыпроявляют широкую вариабельность биохимических свойств в отношении многих углеводов и многоатомных спиртов. При сбраживании углеводов образуется пируват, превращающийся в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Глюкоза, лактоза, маннит сбраживаются с образованием кислоты и газа. Сахароза и дульцит ферментируются непостоянно. Большинство штаммов сбраживает лактозу. Палочкане усваивает цитраты, не разжижает желатину, выделяет индол и не образует сероводород, дает положительную реакцию с метилротом и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, редуцирует нитраты в нитриты, непостоянно декарбоксилирует лизин и орнитин, дегидродизирует аргинин. Она не обладает феланилаланиндезаминазой и цитохромоксидазой, являющейся окислительным ферментом. Не растет на средах с цианистым калием 5. По морфологическим, ферментативным свойствам разновидностине отличаются друг от друга, поэтому решающую роль в идентификации патогенных штаммовиграет определение ее антигенной структуры, в частности фимбриальных адгезинов. Известны штаммы, содержащие фимбрии К 99. Эти антигены спиралевидной формы с диаметром волокна 4,8 нм имеют изоэлектрическую точку 9,7. Число на одной клетке - более 100. Состоят из одинаковых повторяющихся белковых субъединиц с молекулярной массой 18500-19500 6, 7, 8. Кроме того, известны фимбриальные адгезины штамма 41. Белковые субъединицы этих фимбрий построены из 226 аминокислотных остатков, ее молекулярная масса 29500 кДа, изоэлектрическая точка 4,6. На поверхности бактериальной клетки фимбрии 41 образуют нитевидные структуры с диаметром волокон 3,2 нм 9. Опубликованы результаты электронно-микроскопических исследований фимбрий у штаммов 93, 93, 93, которые подтвердили их наличие и показали, что они располагаются на поверхности бактериальной клетки перетрихиально в количестве Х 93 - 100-150 штук, 93 - 150-200 штук 93 - 200-300 штук, а диаметр Х 93 - 7-8 нм 93 2-3 нм 93 - 3-4 нм. Основным структурным компонентом этих фимбриальных адгезинов являлся белок, содержание его было от 5 до 37,5 г/л (в зависимости от типа). Белок фимбрий различался по молекулярной массе (от 32,0 до 35,0 кДа) и изоэлектрическим точкам(от 3,0 до 4,3), что обусловлено разным аминокислотным составом и последовательностью в полипептидной цепи 10, 11. Кроме вышеперечисленных адгезивных фимбриальных антигенов уобнаружены новые адгезины 1541,31 А или ,165,,1987, 2134 Р,24, 20 , 1209, 42, 18, отличающихся молекулярной массой субъединиц, их длиной, диаметром, аминокислотным составом, участвующие в патогенезе колибактериоза животных 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Известны штаммы, содержащие фактор патогенности - фимбриальный адгезин, описанный как антиген К 88 (4) 21. С помощью фимбриального адгезина К 88 бактерии прикрепляются к изолированным клеткам кишечника свиньи и человека. Этот штамм способен у кроликов индуцировать выработку антител на 28 день после вакцинации в титре 112124,9 22. К недостаткам штаммов, содержащих эти антигены, и к недостаткам прототипа следует отнести тот фактор, что в антигенной структуре их содержится узкий спектр специфических белков, комплиментарных возбудителям колибактериоза животных, циркулирующим в определенном регионе Республики Беларусь, что не позволяет использовать их для конструирования профилактических препаратов, т.к. они не способны в силу отсутствия специфических антигенов, обладающих высокими иммуногенными свойствами, полностью защитить животных от поражения инфекцией - колибактериозом животных,одним из возбудителей которой являетсяс адгезивным антигеном 25. 2 10886 1 2008.08.30 Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма, пригодного для конструирования диагностических и профилактических препаратов, обладающего высокой иммуногенностью, содержащего в антигенной структуре адгезивный антиген, комплиментарный антигену бактерий, выделяемых из патологического материала, т.е. циркулирующего в Республике Беларусь возбудителя колибактериоза животных. Поставленная задача достигалась тем, что выделили в 1999 году из слизистой тонкого кишечника десятидневного больного колибактериозом теленка, принадлежавшего колхозу им. Карла Маркса Светлогорского района Гомельской области, штамм .25-20. В результате отбора и проведения исследований был селекционирован штамм 25-20 (КМИЭВ-39 А), отличающийся наличием в антигенной структуре адгезивного антигена 25, идентичного адгезивным антигенам возбудителей колибактериоза телят в Республике Беларусь. Наличие этого антигена установлено с помощью реакции агглютинации на стекле с агглютинирующими антиадгезивными коли-сыворотками. Штамм бактерий 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штамм-антиген, депонирован в коллекции РНИУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной академии наук Беларуси, и ему присвоен номер КМИЭВ-39 А. Использование штамма 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штамма-антигена для получения монорецепторной диагностической сыворотки или в качестве составной части противоколибактериозной вакцины позволяет применять его в комплексе мер по профилактике колибактериоза (эшерихиоза) телят. Таксонометрическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджиотносится к 5-й группе факультативно анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1 - семейство асеае, роду , виду. Тинкториальные признаки. Данный микроорганизм в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, при окраске по Граму имеет вид тонких коротких(0,2-0,72-4 мкм) грамотрицательных палочек. Культурально-морфологические признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура на плотных питательных средах формирует круглые блестящие выпуклые колонии с приподнятым более оптически плотным центром. На среде Эндо бактерия образует колонии красного цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно окрашенным центром. Физиолого-биохимические свойства. На средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм бактерий 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штаммантиген - ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, арабинозу, мальтозу, ксилозу,манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, неподвижен. Антигенный состав. Имеет в своем составе антиген 25, О-антигены, не типируемые коммерческим набором -сывороток, Н-антиген. Чувствительность к антибиотикам. Штамм 25-А 20 (КМИЭВ 39 А) - штамм-антиген - чувствителен к канамицину, флюмеквину, спектиномицину (спектаму), мономицину, умеренно устойчив к стрептомицину, устойчив к ампициллину (амписуру), эритромицину (галлимицину), доксициклину, пенициллину, карбенициллину,олеандомицину, метицилину, линкомицину, кобактану, амоксициллину (ветримоксину),тетрациклину, левомицетину, гентамицину, окситетрациклину, ристомицину. 3 10886 1 2008.08.30 Вирулентность, иммуногенность. Штамм 25-20 (КМИЭВ-39 А) штамм-антиген - патогенен. При внутрибрюшинном введении 0,5 мл суточной бульонной культуры вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. Иммуногенность штамма 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штамма-антигена - составляет 100 , антигенность - 8,650,56 2. Условия хранения. Штамм 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штамм-антиген хранится при 2 4 С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а также в течение 3-6 месяцев на 0,3 ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды (МПБ и МПА на основе перевара Хоттингера) 1-2 раза в месяц, при условии хранения при 2 4 С. 1. Пример выделения. Штамм 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штаммантиген - патологический материал засевали в пробирки с МПБ. на плотную предварительно подсушенную дифференциально-диагностическую среду Эндо и МПА в чашках Петри. Для получения скарификата слизистой тонкого отдела кишечника предварительно удаляли содержимое, скарифицировали концом пастеровской пипетки и растирали шпателем по поверхности среды Эндо следующего состава дистиллированная вода 1000,0 мл питательный агар, сухой 26,5 г ЭКДА 1,22 г фуксин основной 0,23 г сахар молочный (лактоза) 10,7 г динатрий фосфат 0,48 г сульфит натрия безводный 0,83 г натрий углекислый 0,03 г.7,20,2. Оптимальная температура инкубирования 37 С. На элективной среде Эндо через 24 ч образуются круглые средних, иногда мелких размеров колонии (диаметром 2-4 мм), выпуклые или слегка приподнятые в центре, с гладкой поверхностью, ровными краями, красного или малинового цвета на агаре Эндо с наличием или отсутствием металлического блеска. 2. Пример первичной идентификации. Выращенную культуру проверяют на чистоту роста микроскопией мазков. Культура должна иметь типичный рост на питательных средах и морфологию бактериальных клеток, характерную для .(в мазках). 3. Пример серологической идентификации. Штамм 25-20(КМИЭВ-39 А) - штамм-антиген - применяют РА на стекле с агглютинирующими антиадгезивными коли-сыворотками, вначале с комплексной, а при наличии положительной реакции - с моновалентными сыворотками. Антиген для серологических реакций готовят по следующей методике испытуемую культуру, выращенную на скошенном МПА или среде Минка при температуре 37 С в течение 18-20 ч, смывают 2-5 мл физиологического раствора. Постановка реакции каплю диагностической сыворотки наносят на стекло, стерильной пипеткой добавляют каплю испытуемой культуры 25-20(КМИЭВ-39 А) - штамм-антиген, выращенной на скошенном МПА или среды Минка. Культуры, выросшие в чашках Петри, берут бактериологической петлей и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают визуально при легком покачивании стекла при температуре 18-28 С. При появлении мелкозернистого осадка или хлопьев различной величины с полным или частичным просветлением сыворотки реакция считается положительной. Контроли антигена а) стабильность - антигенизотонический раствор натрия хлорида. Реакция отрицательная б) специфичность - антигеннормальная (отрицательная) кроличья сыворотка. Реакция отрицательная. 4 10886 1 2008.08.30 Культура на МПА или среде Минка, давшая положительную реакцию агглютинации с моновалентной антиадгезивной сывороткой и имеющая типичные дляморфологические, тинкториальные и культуральные свойства, считается возбудителем колибактериоза с антигеном 25. 4. Пример определения иммуногенных свойств. Штамм 25-20(КМИЭВ-39 А) - штамм-антиген. Штамм культивировали на агаровой питательной среде,далее смывали стерильным физраствором, доводя до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл. Инактивировали формалином в конечной концентрации 0,4 , в качестве адъюванта добавляли 10 -ные алюмокалиевые квасцы в количестве 10 к объему. Далее двукратно, с интервалом 7 дней, иммунизировали белых мышей. Для этого 10 белым мышам штамм-антиген вводили подкожно в дозе 0,3 мл. Напряженность иммунитета проверяли через 10-14 дней после повторной вакцинации путем внутрибрюшинного заражения 10 вакцинированных и 10 контрольных животных 18-часовой смесью бульонной культуры штамма 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штамма-антигена - в тестдозе 0,5 мл. Штамм-антиген считали иммуногенным, если в опытной группе в живых оставалось не менее 70 животных, при гибели контрольных 90 и более животных в течение 10 суток после заражения. 5. Пример определения антигенной активности. Препаратом из штамма 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штамма-антигена - иммунизировали по 3 кролика двукратно, с интервалом 10 дней в дозе 5 мл с последующим определением титров специфических антител в РА на полистироловых планшетах. Таким образом, получен штамм 25-20 (КМИЭВ-39 А) - штаммантиген, пригодный для конструирования диагностических и профилактических препаратов, обладающий высокой иммуногенностью 100 , а в прототипе - 85 и антигенностью 8,990,56 2, а в прототипе - 6,8 2. С наличием в антигенной структуре адгезивного антигена 25, комплиментарного антигену циркулирующих в Республике Беларусь возбудителей колибактериоза животных, и таким образом способного защитить животных от поражения инфекцией - колибактериозом, обусловленнойс адгезивным антигеном 25. Источники информации 1. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта.- М. Мир, 1997.- Т. 1. С. 185. 2. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Адгезины энтеротоксигенных кишечных палочек роль в патогенезе диарей и генетический контроль // ЖМЭИ. - 1990. -5. - С. 110117. 3. Куликовский А.В., Панин А.Н., Соснина В.В. Токсигенные эшерихии - актуальная проблема ветеринарии и медицины // Ветеринария. - 1997. -3. - С. 25-27. 4. Курлович Д.В., Карпович В.К. Доминирующие микроорганизмы при острых желудочно-кишечных заболеваниях телят. Ветеринарная наука - производству Науч. тр. / БелНИИЭВ.- Мн., 1999. Вып. 34. - С. 146-150. 5. Гутковский А.А., Дворкин Г.Л. Колибактериоз телят и поросят. - Мн. Ураджай,1989. - С. 4-6. 6.,.,..99 // .. - 1981. - . 33. - . 877-883. 7..,10886 1 2008.08.30 9. Капурдова М., Петков М. Получаване, пречиставане и имунохимична характеристика на фимбриален антиген 41 отентерепатогенен щам . . Вет. Сб, 1988. Т. 86,бр. 6. - С. 34-35. 10. Головко А.Н. Фимбриальные адгезины энтеротоксигенных эшерихий // Ветеринария. - 1993. -9. - С. 31-32. 11. Головко А.Н. Способы диагностики и специфической профилактики колибактериоза телят на основе факторов патогенности возбудителя Дис. д-ра.вет.наук 16.00.03.Харьков, 1996. - 272 с. 12.2134. -, , , . , . // .1991. - . 173. -23. - . 76737683. 21..,.88// . . - 1995. - . 51. -6. - . 337-340. 22. Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных Автореферат дис. д-ра вет.наук 16.00.03. - М ООО Техполиграфцентр, 2002. - С. 30 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6