Штамм бактерий Streptomyces netropsis, продуцирующий фосфолипазу D

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Биричевская Лариса Леонидовна Ерошевская Людмила Анатольевна Зинченко Анатолий Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)2003125183 А, 2005. БАРАЙ В.Н. и др. Микробиология и биотехнология ХХ столетия. Материалы международной конференции. Мн., 2002. - С. 169-170. ФЕЩЕНКО Л.Л. и др. Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология. Международный симпозиум. - Москва-Минск, 2001. - С. 424425. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штаммБМ-35, который может быть использован как продуцент фосфолипазы(ФЛД). Этот фермент способен переносить фосфатидильный остаток с молекулы лецитина (синоним - фосфатидилхолин) на первичную -группу некоторых соединений и, в связи с этим, применяется для получения фосфатидилсерина 1, фосфатидильных производных нуклеозидов 2, 3 и др. фармакологически активных соединений общей формулы 21 22 3 , гдеи- остатки природных жирных кислот- остаток серина или нуклеозида. Известен штамм-2, клетки которого секретируют в культуральную среду ФЛД с активностью 3,6 ед./мл при культивировании в течение 72 ч 4. 1 11915 1 2009.06.30 Недостатком указанного штамма является относительно низкая продуктивность в отношении ФЛД и низкая скорость синтеза этого фермента. Известен штамм 19769, синтезирующий внеклеточную ФЛД в количестве до 5 ед./мл культуральной жидкости (КЖ) при культивировании в течение 72 ч 5. Недостатком указанного штамма является сравнительно невысокая активность ФЛД и низкая скорость синтеза этого фермента. Известен штаммБИМ В-235, синтезирующий внеклеточную ФЛД в количестве до 13 ед./мл КЖ при культивировании в течение 14-15 ч 6. Недостатком указанного штамма является сравнительно невысокая активность ФЛД. Из известных штаммов-продуцентов ФЛД наиболее близким по активности (эффективности) к предлагаемому является штамм-6205. Продуцирующая способность штамма-прототипа в отношении ФЛД составляет 1015 ед./мл КЖ при культивировании в течение 15-20 ч 7 (прототип). Недостатками штамма-прототипа являются сравнительно невысокая активность ФЛД и относительно высокая длительность культивирования. Цель изобретения - получение нового штамма бактерийБМ-35 с повышенной активностью ФЛД при менее длительном процессе культивирования. ШтаммБМ-35 получен из музейного штаммаБИМ В-235, согласно метода, описанного в работе 4, а именно путем отбора наиболее активных вариантов при многократном рассеве исходной культуры на плотной агаризованной минеральной среде с соевым лецитином в качестве единственного источника углерода. Среда для селекции (рН 7,0) имела следующий состав, (г/л) Лецитин - 10,0 3 - 2,0 24 - 1,0- 0,5 472 - 0,5 472 - 0,01. Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологииБеларуси под коллекционным номером БИМ В-428 Д и характеризуется следующими свойствами. Морфологические признаки. Вегетативные гифы диаметром 0,8-1,2 мкм образуют хорошо развитый истинный,нефрагментированный, разветвленный мицелий. Воздушный мицелий хорошо выражен,имеет характерную мутовчатую (вертициллятную) организацию. На агаризованной овсяной среде (30 С, 7 суток культивирования) колонии круглой правильной формы, диаметром 2-5 мм, выпуклые. Окраска колоний (обусловлена цветом воздушного мицелия и споровых масс) сначала белая, с возрастом переходит в бежевую с розоватым (бледно-лиловым) оттенком. Поверхность колоний вначале гладкая, позднее образуется хорошо выраженный дымчатый воздушный мицелий, края колоний относительно ровные, структура бархатистая. Реверзум колоний желтовато-коричневый, обусловлен цветом субстратного мицелия, врастающего в агар. Цепочки артроспор образуются на мутовчатых спороносцах (вертициллах) воздушного мицелия. Споры неподвижные, гладкие, округлые. Характерно образование коричневого пигмента, диффундирующего в среду. Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства. Имеет широкий диапазон температуры роста 10-45 С. Оптимум роста - 26-32 С при рН 6,5-8,0. Аэроб. Хемоорганотроф. По Граму окрашивается положительно. Гидролизует крахмал и желатину, не гидролизует казеин. 2 11915 1 2009.06.30 В процессе роста образует кислоту из трегалозы и рибозы. Утилизирует -глюкозу,глицерин, инозит. Слабо утилизирует фруктозу и сахарозу, не усваивает -арабинозу,раффинозу, целлюлозу, -рамнозу, -ксилозу, маннит и сорбит. Усваивает -пролин, но не -метионин. Деградирует цитрат, -тирозин и ксантин, не деградирует эскулин. 2 не образует. Продуцирует меланиновые пигменты. Гемолитическими свойствами не обладает. Не токсичен для теплокровных животных. Содержание ГЦ в составе ДНК 71,5 мол.(определено оптическим методом). Штамм сохраняет жизнеспособность не менее полугода при хранении в холодильнике(4-6 С) на скошенной агаризованной овсяной среде. Для длительного хранения особенно подходит метод криоконсервации в парах жидкого азота, а также лиофилизация (криопротектор - 10 -ное обезжиренное молоко). При выращивании на полноценных средах, богатых органическим азотом, клеткиБМ-35 способны продуцировать внеклеточную ФЛД в количестве 24 ед. акт./мл КЖ. Для культивированияБМ-35 с целью получения ФЛД, применяют питательную среду (рН 7,2), приготовленную на водопроводной воде, следующего составаглюкоза - 1,0 дрожжевой экстракт - 2,0. Культивирование стрептомицета проводят на орбитальной биологической качалке при частоте оборотов платформы 170-190 об/мин и температуре 28-30 С в течение 14-15 часов в 250 мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл питательной среды. По окончании культивирования КЖ фильтруют через бязь. Активность ФЛД в фильтрате КЖ определяют в реакции синтеза фосфатидилэтанола из фосфатидилхолина (соевый лецитин -200 фирмы, Германия) и этанола. К реакционной смеси, состоящей из 200 мкл хлороформа с растворенным в нем фосфатидилхолином в количестве 5 мкмоль и 195 мкл 100 мМ -ацетатного буфера с 50 мМ 2, содержащего 200 мкмоль этанола, прибавляют 5 мкл фильтрата КЖ и инкубируют при 37 С в течение 10 мин. Реакцию останавливают, добавляя к реакционной смеси 100 мкл 1. Для лучшей экстракции фосфолипидов и расслоения фаз вносят 400 мкл смеси хлороформ-метанол (21). После центрифугирования (5 мин, 3000 ) органическую фазу отделяют и хроматографируют на тонкослойной пластинке -254 фирмы(Германия) в системе растворителей хлороформ-метанол-25 -ный водный аммиак (741). Фосфолипиды обнаруживают, используя специфический реагент 8,либо 10 раствор 24 в метаноле с последующим нагреванием пластинки до 200 С. Целевой продукт идентифицируют сравнением с положением образца-свидетеля. Количество образовавшегося фосфатидилэтанола определяют по фосфору методом Васьковского 8. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое обеспечивает образование фосфатидилэтанола в количестве 1 мкмоль за 1 мин в указанных выше условиях реакции. Активность штаммаБМ-35 в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в табл. 1. 11915 1 2009.06.30 Таблица 1 Сравнение активности предлагаемого и известных штаммов микроорганизмов Штамм Активность ФЛД Длительность Источник информации ед./мл отн.культивирования,ч КЖБМ-35 24 100 14-15 Предлагаемое решение 10-15 42-63 15-20 7-6205 (прототип)13 54 14-15 6 БИМ В-235 (аналог 3)5 21 72 519769 (аналог 2)3,6 15 72 4-0848 Из данных табл. 1 следует, что эффективность штаммаБМ-35 значительно выше любого из известных штаммов микроорганизмов. Дополнительным преимуществом этого штамма является сокращенная (до 14-15 ч) продолжительность выращивания. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения ФЛД. Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения. Пример 1. КультивированиеБМ-35 в оптимальных условиях. КультивированиеБМ-35 проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при температуре 28 С в течение 15 ч. Питательная среда для выращивания приготовляется на водопроводной воде и имеет следующий состав, г/л глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 20 (рН 7,2). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 ати, 15 минут. Объем питательной среды составляет 40 от объема колбы (100 мл). По окончании выращивания культуральную жидкость фильтруют через ткань (бязь),мицелий отжимают. Фильтрат КЖ используют в качестве источника ФЛД. Активность ФЛД, определенная как описано выше, составляет 24 ед./мл. Фермент в составе фильтрата КЖ может храниться при 4-6 С (в холодильнике) без существенной (менее 10 ) потери активности в течение 6 месяцев. Пример 2. Динамика накопления ФЛД в КЖ при культивированииБМ-35. КультивированиеБМ-35 проводят в условиях примера 1 за исключением того, что активность ФЛД определяют на разных стадиях процесса выращивания микроорганизма. 11915 1 2009.06.30 В табл. 2 представлена зависимость фосфолипазной активности от продолжительности выращивания заявляемого штаммаБМ-35. Из таблицы видно,что предлагаемый в качестве продуцента ФЛД штамм обеспечивает накопление максимальной активности через 14-15 ч культивирования. Таблица 2 Динамика накопления в среде ФЛД при культивированииБМ-35 Время культивирования, ч Активность ФЛД ед./мл КЖ отн.5 7,4 31 10 16,3 68 13 22,8 95 14 23,8 99 15 24,0 100 18 23,9 100 19 23,5 98 20 23,1 96 24 22,0 92 Пример 3. Получение препарата ФЛД. Культивирование штаммаБМ-35 проводят в условиях примера 1. Затем 100 мл фильтрата КЖ охлаждают и к нему приливают тонкой струйкой при перемешивании охлажденный до -18 С ацетон до 63 конечного объема. После формирования осадка при 4 С в течение 30 мин, его осаждают центрифугированием при 5000(5 мин), высушивают под вакуумом и растирают в фарфоровой ступке. Получают 0,2 г тонкодисперсного порошка с активностью 12 ед./мг препарата. ФЛД в составе сухого препарата может храниться при 4-6 С (бытовой холодильник) без существенной потери активности не менее 1 года. Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению с известным штаммомпродуцентом ФЛД значительно более высокой продуктивностью (24 ед. акт./мл КЖ против 10-15 ед. акт./мл КЖ) и меньшей продолжительностью культивирования (14-15 ч вместо 15-20 ч). Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов-продуцентов ФЛД. Источники информации 1. Патент США 6878532, 2005. 2..,.,.,.,.,.-.5-55--// . . . - 1995. - . 3. -3. - . 235-243. 3. - .,.,.,.// . . 2005. . 27,8. . 535-543. 4.Т.,.,.// . . - 2000. - . 22. -20. . 1587-1590. 5. Патент РФ 2289625, 2005. 6. Биричевская Л.Л., Зинченко А.И. Влияние состава питательной среды и условий культивирования на продуцирование фосфолипазыкультурой 5 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6