Штамм Pasteurella multocida КМИЭВ-13-Х – штамм-антиген

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Автор Лях Юрий Григорьевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(56) Лях Ю.Г. Эпизоотология и специфическая профилактика пастереллеза свиней,обусловленногосероварами А и Д. Автореферат диссертации. Минск, 2003. - С. 4-6, 25-27.6012 1, 2004. Лях Ю.Г. и др. Ученые записки Учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. Т.40. Ч. 1. - Витебск, 2004. - С. 243-244. Геведзе В.И. Пастереллез крупного рогатого скота. - Мн. Ураджай, 1989. С. 18-21. Домарадский И.В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. М. Медицина, 1971. - С. 38-41.(57) ШтаммКМИЭВ-13-Х - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к биотехнологии,и касается штамма, выделенного от поросят, больных пастереллезом, обладающего антигенной активностью, и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических биопрепаратов. Известен штаммД, населяющий слизистые оболочки органов дыхания млекопитающих (редко человека) и птиц 1. Возбудитель пастереллеза - неподвижная овальная грамотрицательная бактерия шириной 0,25-0,5 мк, длиной 0,5-1,5 мк,жгутиков и спор не имеет, анилиновыми красками окрашивается биполярно, имеет капсулу. Штаммы пастерелл представляют собой единый род бактерий с почти одинаковыми морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, но различаются вирулентными свойствами. Вирулентные штаммы пастерелл, выделенные из трупов животных и птиц, павших при остром течении болезни, чаще всего растут на агаре в виде гладких, выпуклых, слегка опалесцирующих серовато-белых блестящих колоний с ровными краями - -форма. -формы растут на агаре в виде голубоватых матовых шероховатых колоний с неровными краями. Вирулентность таких штаммов понижена, иногда они авирулентны. В мазках, взятых из бульонных или полужидких культур -формы пастерелл, видны однородные мелкие овоиды или коккобактерии, иногда биполярно окрашенные. В мазках 10966 1 2008.08.30 бактерий -формы наблюдается полиморфизм единичные овоиды или коккобактерии,короткие или длинные нити. Штамм чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда. Недостатком данного штамма является слабая вирулентность. Заражение лабораторных животных практически не вызывает их гибели. Известен штаммД, участвующий в патологических процессах органов дыхания свиней и крупного рогатого скота. Заражение вызывает разведение 10-6-10-9 вирулентных пастерелл. Вирулентность определяется путем постановки биологической пробы на белых мышах массой 16-18 г для заражения которых используют 18-24-часовую бульонную культуру пастерелл. Для изоляции отдельных колоний пастерелл из первичных высевов применяют дробный посев исследуемого патологического материала на чашки Петри с обогащенным МПА. На простом аминопептидном и сывороточном МПА .Д образует прозрачные серовато-белого цвета колонии с ровными краями, диаметром 2-3 мм. Первичный рост может быть также в виде тонкого налета на поверхности среды. На необогащенном МПА пастереллы растут в виде нежных мелких росинчатых колоний, слегка опалесцирующих в проходящем свете. По внешнему виду различают три основных типа колоний слизистые(М-форма), гладкие (-форма) и шероховатые (-форма). Слизистые колонии наиболее крупные, имеют белый цвет, гладкие края и характерную влажную поверхность 2. Слабый рост указанного штамма на жидких питательных средах указывает на невозможность использования данного штамма в биологической промышленности. Известен штаммД, участвующий в патогенезе пастереллеза, выделенный из крови животных и птиц, который в разведении 10-21 вызывал гибель белых мышей. В мазках, приготовленных из бульонных культур и окрашенных по Грамму,данный микроорганизм имеет вид мелких грамотрицательных кокко-овоидов размером 0,2-1,60,15-0,26 мкм, располагающихся изолированно, попарно и реже цепочками. Указанный штамм пастерелл имеет специфический капсульный антиген и продуцирует гиалуроновую кислоту 3. Чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда, стрептомицину. Иммуногенность указанного штамма составляет 81 . Такого показателя иммуногенности для изготовления высокоактивных вакцин недостаточно, и поэтому данный штаммД не может быть использован при изготовлении вакцин. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма, пригодного для конструирования диагностических и профилактических препаратов, обладающего высокой (90-97 ) иммуногенностью. Поставленная задача достигалась тем, что в качестве штамма-антигена использовали полученный штамм 90-Д (КМИЭВ-13-Х), выделенный в 1990 году в колхозе Рассвет Несвижского района Минской области из легочной ткани телят возрастом 1-1,5 месяцев. В результате отбора и проведения исследований был селекционирован штамм 90-Д (КМИЭВ-13-Х), отличающийся наличием высокой иммуногенности, что позволяет использовать его для изготовления вакцины. Штамм бактерий 90-Д (КМИЭВ-13-Х) депонирован в коллекции РНИУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной академии наук Беларуси. Использование штамма 90-Д (КМИЭВ-13-) для получения антигена в качестве составной части противопастереллезных вакцин позволяет применять его в комплексе мер по профилактике пастереллеза телят и поросят. Таксонометрическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджиотносится к 5-й группе факультативно анаэробных грамотрицательных палочек,подгруппе 3 - семейство , роду , виду. Патогенность для животных. Штамм 90 (КМИЭВ-13-Х) патогенен - при внутрибрюшинном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. 2 10966 1 2008.08.30 ЛД 100 для белых мышей составляет 0,5 мл 3 18-часовой бульонной культуры. Гибель животных наступает в течение 24-48 ч. Тинкториально-морфологические признаки. Данный микроорганизм в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, при окраске по Граму может иметь вид сферических, овальных или палочковидных клеток, 0,3-1,50,15-0,25 мкм, одиночные, реже в парах или коротких цепочках. Обычно окрашиваются биполярно, особенно в препаратах,приготовленных из инфицированных тканей животных. Грамотрицательные. Неподвижные. Культуральные, физиологические, биотехнологические и биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Хемоорганотофоры, обладающие и дыхательным, и бродильным типами метаболизма. В МПБ в бульоне на основе перевара Хоттингера в первые дни выращивания (24-48 ч) дает легкое равномерное помутнение сред, в большинстве случаев без образования на поверхности бульона пленки и пристеночного кольца. На 3-5-й день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании пробирки в виде неразбивающейся косички с полным просветлением бульона. Хороший рост пастереллезных бактерий отмечается при обогащении сред 5-10 -ной инактивированной стерильной сывороткой лошади и 2 -ным стерильным 40 -ным раствором глюкозы. Ростовые качества питательных сред для выращивания пастерелл можно улучшить добавлением 2 -ного стерильного дрожжевого экстракта. Для роста пастерелл необходима слабощелочная среда. Наиболее оптимальный рост их наблюдается при рН 7,2-7,4 и температуре воздуха 37 С в течение 24-48 ч. Маркерные признаки (генетические, иммуногенные, биохимические, физиологические). В биохимическом отношении катболизируют -глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты. Восстанавливают нитрат до нитрита. Пробы с метиловым красным и на образование ацетоина (Фогеса-Проскауэра) отрицательные. Антигенный состав. Имеет в своем составе К- и О-антигены. Исследуемые культуры засевают в центрифужные пробирки, содержащие по 3 мл МПБ из перевара Хоттингера с добавлением 10 нормальной сыворотки крови лошади, инкубируют 18-24 ч при 37 С,затем центрифугируют при 1000 об./мин в течение 30 мин. После чего удаляют 2,5 мл надосадочной жидкости, а в оставшихся 0,5 мл ресуспендируют осевшие бактериальные клетки. В каждую пробирку вносят по 0,5 мл раствора трипофлавина, тщательно перемешивают, выдерживают 30 мин при комнатной температуре, затем учитывают результаты. Культуры, относящиеся к серовару Д, образовывают флокулят, оседающий на дне пробирки и не разбивающийся при встряхивании. Чувствительность к антибиотикам. Штамм 90-Д (КМИЭВ-13-Х) устойчив к основным антибиотикам кроме антибиотиков тетрациклинового ряда. Условия хранения. Хранят в ампулах при 2-4 С после лиофильного высушивания в полужидком агаре в течение 5 лет. Жизнеспособность поддерживается путем пересева на питательные среды - МПБ Хоттингера и МПА на основе перевара Хоттингера 1 раз в течение 1 месяца при условии хранения 2-4 С. Вирулентность. Штамм 90-Д (КМИЭВ-13-Х) обладает вирулентностью. При внутрибрюшинном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. ЛД 100 для белых мышей составляет 0,5 мл 3 18-часовой бульонной культуры. Иммуногенность. Иммуногенность штамма 90-Д (КМИЭВ-13-Х) составляет 90-97 . Онкогенность. Данные отсутствуют. 1. Пример выделения штамма 90-Д (КМИЭВ-13-Х) - штамма антигена. Штамм 90-Д (КМИЭВ-13-Х) выделяли путем посева кусочков патологически измененных легких телят, больных пастереллезом, на МПБ и МПА на основе перевара Хоттингера. Для приготовления бульона Хоттингера перевар разводят дистиллированной водой до содержания азота 200 мг . К бульону добавляют 0,5 натрия хлорида и 1 пептона, и 10 дрожжевого экстракта. рН доводят до 7,4-7,6. 3 10966 1 2008.08.30 2. Пример определения патогенности штамма 90-Д (КМИЭВ-13-Х) штамма-антигена. Изучение патогенных свойств штамма 90-Д(КМИЭВ-13-Х) провели на белых мышах. Исследования проводили путем введения 20 белым мышам массой 14-16 г подкожно в дозе 0,5 мл суточной культуры пастерелл. Животные заболели и в течение 24-48 ч пали. При вскрытии павших животных на внутренних органах отмечены точечные кровоизлияния, пневмония. 3. Пример определения иммуногенной активности штамма 90-Д(КМИЭВ-13-Х) - штамма-антигена. Иммуногенную активность штамма 90-Д (КМИЭВ-13-Х) изучали на белых мышах массой 14-16 г (100 иммунизированных и 100 контрольных). В результате исследований иммуногеной активности вакцины, изготовленной на основании выращенных пастерелл, установлено, что двукратная иммунизация лабораторных животных приготовленным экспериментальным образцом вакцины в дозах 0,2 и 0,3 мл с интервалом 7 дней в 97 случаях предохраняет их от заболевания и падежа при заражении пастереллами. Таким образом, штамм 90-Д (КМИЭВ-13-Х) является активным в антигенном отношении, обладает необходимой иммуногенной активностью (97 ) по сравнению с известным штаммом (81 ) и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов в качестве штамма-антигена. Источники информации 1. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоулта. - М. Мир, 1980. С. 180-203. 2. Геведзе В.И. Пастереллез крупного рогатого скота. - Мн. Ураджай, - 1989. - С. 19-21. 3. Домарадский И.В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. - М. Медицина, 1971. - С. 39-41 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4