Трипептид, обладающий антитромботическим действием, и способ его получения

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Мельник Ольга Викторовна Голубович Владимир Петрович Мартинович Вера Павловна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56). . . Доклади на Българската академия на науките,2002. -55,11. - . 51-54.2925 1, 1999.2171807 2, 2001.2174520 2, 2001.(57) 1. Трипептид формулы , обладающий антитромботической активностью. 2. Способ получения трипептида по п. 1 жидкофазным методом, причем для блокирования гуанидиновой группы аргинина используют реакцию протонирования, а в качестве конденсирующего агента используют дициклогексилкарбодиимид. Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии и медицины, а именно к трипептиду , который ингибирует процесс агрегации тромбоцитов и может быть использован как препарат с антитромботическим действием. Самой опасной патологией таких сердечно-сосудистых заболеваний, как инфаркт миокарда, атеросклероз, хроническая ишемическая болезнь сердца, является образование тромбов в кровеносных сосудах, что приводит к нарушению кровообращения и к разрыву ткани. Процесс тромбообразования, вызываемый агрегацией тромбоцитов, связан со взаимодействием фибриногена и гликопротеиновых рецепторов, находящихся на поверхности тромбоцитов. Известны пептиды, аналоги , являющиеся ингибиторами агрегации тромбоцитов. Тетрапептиды , , ингибируют аденозиндифосфат-индуцированную агрегацию тромбоцитов при внесениии их в плазму крови в дозах от 10-200 мкМ 1, 2. Однако эти соединения, содержащие остатки природных аминокислот в -конфигурации, энзиматически нестабильны и легко разрушаются протеиназами плазмы крови. Более стабильны пептидомиметики на основе последовательности , которые обладают высокой антитромботической активностью. Наиболее активными соединениями являются 8-гуанидиноктаноил-Ар-Ре 3, а также производные бензамидина 4 и п-аминобензамидина 5, п-аминобензойной кислоты 6. Несмотря на различия в структурах данных соединений, общим для них является наличие свободных положительно заряженной гуанидино- или аминогруппы и отрицательно заря 9947 1 2007.10.30 женной карбоксильной, необходимых для связывания с тромбоцитарными рецепторами 7. Однако синтез этих соединений является сложным и дорогостоящим. Кроме того, в отличие от пептидных ингибиторов тромбообразования эти соединения токсичны. Задачей настоящего изобретения является создание нового трипептида ,структурного аналога последовательности 92-94 А-цепи фибриногена, отличающегося высоким уровнем антитромботической активности по сравнению с известными пептидами. Модификация последовательности - введение дополнительного метиленового звена за счет замены остатка глицина на -аланин - приводит к увеличению подвижности центрального остова в молекуле, что, в свою очередь, вызывает увеличение антитромботической активности. Теоретический конформационный анализ показал, что в данном соединении расстояние между гуанидиновой группой аргинина и -карбоксилом аспарагиновой кислоты оптимально для связывания с рецепторами. Чистота и структура созданного трипептида подтверждены методами масс-спектрометрии, аминокислотного анализа, ВЭЖХ. Масс-спектр конечного трипептида получили на масс-спектрометре РЕ 150 ( , США) с использованием- источника ионов. Массспектр/ 361,2 МН, 383,2, 405,2 -2. Аминокислотный анализ пептида, гидролизированного в запаянной ампуле 6 н НС в течение 20 часов при 110 С, выполнили на автоматическом аминокислотном анализаторе(Швеция). Данные аминокислотного анализа аргинин 1,05 (1), -аланин 0,90 (1), аспарагиновая кислота 1,00 (1). Аналитическую ВЭЖХ созданного соединения провели на хроматографе фирмы(32, 966 фотодиодный детектор, колонка 2015218 (2,1250 мм. Используемый градиент концентраций от 10 до 40 ацетонитрила в воде с добавлением 0.1. Скорость потока 1 мл/мин. По данным ВЖЭХ содержание целевого пептида - 92 . Для подтверждения антитромботической активности заявляемого трипептида было проведено исследование аденозиндифосфат-индуцированной агрегации тромбоцитов (пример 1). Антитромботическую активность соединения оценивали с использованием анализатора агрегации тромбоцитов АР 2110 (Солар, Беларусь). В качестве индуктора агрегации применяют аденозиндифосфат (фирма ). Другой задачей изобретения является способ получения заявляемого соединения. Известен способ получения содержащих пептидов 8 (прототип), включающий в себя жидкофазный способ с применением дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента, в котором для защиты гуанидиновой группы аргинина используется нитро-группа, а для блокирования -карбоксила аспарагиновой кислоты - бензильная группировка. Удаление этих защитных групп проходит в условиях каталитического восстановления и требует достаточно много времени. Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что позволяет вводить аргинин в реакцию без применения ковалентной защиты. Для блокирования гуанидиновой группы аргинина использовали реакцию протонирования. Трипептид получали последовательным присоединением -защищенных аминокислот к С-концевым фрагментам. Аспарагиновую кислоту вводили в синтез в виде диметилового эфира. Деблокирование полученного трипептида осуществляли в две стадии - щелочной гидролиз использовали для деблокирования карбоксильных групп и обработку сухим хлороводородом в этилацетате - для удаления кислотолабильных трет.бутилоксикарбонильных групп. Заявляемый способ позволяет получать целевой пептид с минимальным числом стадий (не требуется проведение дополнительной стадии каталитического восстановления для удаления нитро- и бензильной групп) и высокими постадийными выходами. Сущность заявляемого способа подтверждается примером 2. 2 9947 1 2007.10.30 Приведены хроматографические подвижности в системах (А)-хлороформ-метанол 20- -ный аммиак, 604010, (Б)-бутанол-уксусная кислота-вода, 401010. Удельное вращение определяли на спектрополяриметре -20 (, Япония). Температуру плавления определяли на приборе Кофлера (приведена без коррекции). Пример 1.ингибирование аденозининдифофат - индуцированной агрегации тромбоцитов. Смешивают в соотношении 91 донорскую кровь и 3,8 -ный раствор цитрата натрия. Центрифугируют полученную смесь 5 минут при 1000 об/мин. Образовавшуюся богатую тромбоцитами плазму отделяют, а оставшуюся центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин для получения безтромбоцитной плазмы. Тромбоцитная плазма с содержанием тромбоцитов 200-300 тысяч/мкл используется для исследования антитромботической активности соединения. Тромбоцитную плазму(400 мкл) вносят в кювету, затем добавляют индуктор агрегации - АДФ (50 мкл) с начальной концентрацией 15 мкМ. Агрегометр автоматически регистрирует протекание процесса агрегации по изменению коэффициента светопропускания раствора течение 10 минут. При исследовании соединения в тромбоцитную плазму (400 мкл) вносят (50 мкл) с различными концентрациями в пределах 0,5-100,0 мкМ и инкубируют полученную смесь в течение двух минут при 37 С. Затем добавляют индуктор агрегации АДФ в количестве 50 мкл с концентрацией 15 мкМ и фиксируют протекание агрегации в течение 10 мин. Получают значения степени агрегации при семи различных концентрациях в пределах от 0,5 до 100,0 мкМ. Опыты проводят двукратно. Для количественной оценки биологической активности используют величину 50, представляющую собой концентрацию вещества, при которой максимальная амплитуда агрегации тромбоцитов составляет 50 исходного уровня (таблица). Ингибирование аденозиндифосфат-индуцированной агрегации тромбоцитов аналогами 2 Пептид Из представленных в таблице данных можно сделать вывод, что трипептид проявляет наибольшую активность по отношению к ингибированию агрегации тромбоцитов по сравнению с известными пептидными соединениями, содержащими последовательность. Данное соединение может найти применение в медицине в качестве антитромботического средства. Заявляемый трипептид обладает повышенной устойчивостью к расщеплению протеолитическими ферментами за счет присутствия неприродной аминокислоты -аланина. Пример 2. Получение дигидрохлорида аргинилаланил-аспарагиновой кислоты. Стадия 1. Получение-трет.бутилоксикарбонилаланил-аспарагиновой кислоты диметилового эфира . К раствору 0,96 г (4,1 ммоль) хлоргидрата диметилового эфира аспарагиновой кислоты в 4,5 мл ДМФ прибавляют 1,1 мл триэтиламина (8,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 минут и затем вносят 0,70 г (3,7 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-аланина. После охлаждения до 0 С в реакционный сосуд прибавляют последовательно 0,52 г (3,9 ммоль) гидроксибензатриазола (НОВТ) и 0,91 г (4,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК). Реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч при 0 С и 4 ч при комнатной температуре. После окончания реакции осадки дициклогексилмочевины (ДЦГМ) и ТЭАНС отфильтровывают, промывают на фильтре 2 мл ДМФ. В фильтрат добавляют 10 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной 3 9947 1 2007.10.30 кислоты, 5 -ным раствором аНСО 3, насыщенным раствором натрия хлорида, водой,сушат над 24. После сушки этилацетат упаривают, а образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира гексаном и сушат над Р 2 О 5. Получают 0,84 г (выход 68 ) соединения 1, 209,5 (С 1, МеОН)0,80 (А), 0,55 (Б). Стадия 2. Получение хлоргидрата -аланил-аспарагиновой кислоты диметилового эфира . К раствору 0,83 г (2,5 ммоль) 2 в 2,0 мл этилацетата и добавляют 5,7 мл 4,5 н раствора НС в этилацетате. Перемешивают образовавшуюся взвесь в течение 50 мин, затем осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре этилацетатом, эфиром, сушат в эксикаторе над . Получают 0,66 г (выход 99 ) 20 - 3,5 (С 1, МеОН)0,26 (А), 0,78 (Б). Стадия 3. Получение -трет.бутилоксикарбонил-аргинилаланил-аспарагиновой кислоты диметилового эфира . К раствору 0,63 г (2,3 ммоль) 2 в 3,5 мл ДМФ добавляют 0,63 г(2,3 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-аргинина и перемешивают полученный раствор 20 мин. Охладив реакционную колбу до 0 С, вносят последовательно 0,32 г (2,4 ммоль) НОВТ и 0,58 г (2,8 ммоль) ДЦГК. Время прохождения реакции - 4 часа. После окончания реакции осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают небольшим количеством ДМФ, а к фильтрату добавляют 20,0 мл безводного эфира. Полученное масло дважды переосаждают из метанола эфиром и сушат в эксикаторе над Р 2 О 5. Получают 0,91 г(выход 75 ) соединения , Т. пл. 70-73 С 20-11,5 (С 1, МеОН)0,33, 0,67 (Б). Стадия 4. Получение -трет.бутилоксикарбонил-аргинилаланил-аспарагиновой кислоты . К раствору 0,81 г (1,6 ммоль) соединенияв 19,2 мл метанола добавляют 1,9 мл 2 н.и перемешивают полученный раствор в течение часа. После окончания гидролиза реакционную смесь нейтрализуют до рН 2-3 4,5 н раствором НС в этилацетате, растворитель упаривают в вакууме досуха, а к образовавшемуся остатку добавляют 2,0 мл ДМФ. Нерастворившийся осадок натрия хлорида отфильтровывают, в фильтрат приливают 8,5 мл безводного эфира. После переосаждения из метанола эфиром и сушки в эксикаторе над Р 2 О 5 получают 0,54 г (выход 68 ) соединения ,0,15 (А), 0,57 (Б). Стадия 5. Получение трипептида 2 . К суспензии 0,50 г (1,0 ммоль) соединенияв 2 мл этилацетата добавляют 4,6 мл 4,5 н раствора НС в этилацетате. Реакционную смесь перемешивают около часа, затем растворитель упаривают, а остаток промывают этилацетатом, эфиром. Сушат в эксикаторе над Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5