Способ получения средства, обладающего гипоазотемическим действием

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(71) Заявитель Белорусское производственное объединение медицинских препаратов (73) Патентообладатель Белорусское производственное объединение БелмедпрепаратыБелмедпрепараты(57) Способ получения средства, обладающего гипоазотемическим действием, путем многократной экстракции растительного сырья раствором этилового спирта, отгонки экстракта под вакуумом, очистки хлороформом с последующей хроматографией на полиамиде с использованием в качестве элюента раствора этилового спирта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют листья бегонии краснолистной ( ).(56)1531278, МПК 61 35/78, 1989. Изобретение относится к медицине и касается способа получения из растительного сырья средства, обладающего гипоазотемическим действием. Известен способ получения веществ, обладающих гипоазотемическим действием из растительного сырья - левзеи сафлоровидной. Но в доступной нам литературе данных о практическом применении левзеи сафлоровидной в качестве гипоазотемического средства нами не обнаружено. Прототипом данного изобретения является гипоазотемическое средство из побегов леспедецы двухцветной леспефлан 1. Однако гипоазотемические свойства леспефлана в эксперименте на животных проявляются только на токсической модели почечной недостаточности, в то время как исследуемое средство эффективно как на токсической, так и на токсико-ишемической модели острой почечной недостаточности. Кроме того природные условия Республики Беларусь не позволяют использовать леспедецу двухцветную для промышленного производства препарата, потребность в котором велика в связи с ростом почечной патологии, часто приводящей к острой и хронической почечной недостаточности. В основе метода получения веществ, обладающих гипоазотемическим действием лежат экстракция 20-80 этиловым спиртом растительного сырья, упаривание экстракта, очистка его хлороформом, с последующей хроматографией на колонке с полиамидом. Целевой продукт элюируют 80 этиловым спиртом, элюат упаривают и сушат в вакууме. Задача, на решение которой направлено данное изобретение, получение средства, из доступного и дешевого сырья, обладающего более выраженным гипоазотемическим действием. Данная задача решается путем применения в качестве сырья листьев бегонии краснолистной. Бегония краснолистная -- получена от скрещиванияи. Это многолетнее мягковорсистое травянистое растение с толстыми блестящими листьями. Сверху темно-зеленые, с нижней стороны - красноватые, листья толстые, веслообразной формы, длинностебельчатые, 7-21 см длины и 5-15 см ширины, короткозаостренные, крупно угловатозубчатые, с маленькими зубчиками и ресничками. Черешок длинный, 6-18 см длины, в редко расположенных ланцетовидных бахромчатых пурпурных чешуях, на верхушке соединенных в манжетку. Стебель толстый, мясистый, извилистый. Цветонос длинный, 30-50 см. Цветки в многоцветковых соцветиях мелкие, 1,8-2 см в диаметре, белые. Цветет обильно и продолжительно. Бегония краснолистная - высокоурожайное (4000 ц/га), содержащее витамины, хорошо сбалансированное по биохимическому составу, легко воспроизводимое растение закрытого грунта, что обеспечивает экологическую чистоту исходного сырья. Поставленная задача решается путем многократной экстракции тельного сырья 70 этиловым 2612 1 спиртом, отгонки экстракта под вакуумом при температуре 40-50 С, трехкратной очистки хлороформом с последующей хроматографией на полиамиде с использованием в качестве элюента раствора этанола и выпариванием элюата под вакуумом.. 1 кг воздушно-сухой массы листьев бегонии краснолистной экстрагируют 70 этиловым спиртом (этанолом) при комнатной температуре. Извлечение проводят трехкратно (один слив в сутки). Количество растворителя в первую экстракцию составляет 12 л, а в последующие - по 9 л. Этанольные экстракты объединяют, этиловый спирт отгоняют в вакууме при температуре 40-50 С до объема 200 мл, затем приливают 200 мл воды и вновь отгоняют до полного удаления этилового спирта. Этиловый спирт может быть использован многократно с небольшими потерями. Для удаления балластных веществ экстракт обрабатывают хлороформом (3 раза по 150 мл). Далее водный остаток пропускают через колонку, наполненную полиамидом (150 г). Флавоноиды с колонки элюируют 70 и 96 этиловым спиртом. Элюаты выпаривают досуха под вакуумом при температуре 40 С. Из 1 кг воздушно-сухой массы листьев бегонии краснолистной вышеуказанным способом можно получить 20 г суммарного комплекса биологически активных веществ (БАВ). Суммарный комплекс БАВ бегонии краснолистной - аморфный порошок серо-зеленого цвета, плохо растворим в воде, хорошо в этиловом спирте и диметилсульфоксиде. Суммарный препарат после сушки до постоянного веса содержит 80 флавоноидов и 3 хлорогеновых кислот, причем в составе препарата фитохимическим методом обнаруживаются все компоненты флавоноидов, содержащихся в нативных этанольных вытяжках из листьев. Идентифицировано 10 флавоноидных веществ 3-о-метилкверцетин, 3-о-метилкемпферол, кверцетин, лютеолин, кверцитрин, цинарозид, изовитексин, ориентин, витексин и изоориентин. Полученный препарат можно использовать в качестве средства, снижающего содержание продуктов азотистого обмена в сыворотке крови, то есть для профилактики и лечения острой и хронической почечной недостаточности. Качественный состав Качественный состав фенольных соединений из спиртовых извлечений листьев бегонии краснолистной анализировали хроматографически. Обнаружили 10 веществ флавоноидной природы. Используя метод хроматографии на бумаге, а также системы растворителей 1) бутанол-1-уксусная кислота-вода, 311 2) 15 уксусная кислота 3) хлороформ - уксусная кислота, 32 и 4) 40-ная уксусная кислота в индивидуальном состоянии, получили препаративно 4 флавоноидных агликона и 6 гликозидов. Агликоны Вещество 1. Дает положительную реакцию по Брианту (октанол) - окрашенные продукты переходят в слой октанола, что указывает на агликоновый характер соединения. Окраска вещества в УФ-свете темнопурпурная, а в парах аммиака - темно-коричневая, что указывает на флавоновую природу. В нейтральном этанольном растворе спектры вещества 1 имеют максимум 1 и 2 полос поглощения соответственно 360 и 262 нм. Добавление ацетата натрия вызывает незначительный сдвиг 2 полосы на 8 нм, что указывает на присутствие свободной гидроксильной группы в положении С-7. Наличием гидроксильной группы в положении С-5 можно объяснить батахромный сдвиг 1 полосы на 38 нм с А 1 С 13. О наличии 3,4-ортодиоксигруппы свидетельствует батахромный сдвиг на 21 нм 1 полосы при добавлении Н 3 ВО 3. При деметилировании вещества 1 (30 мл раствора агликона 30 мл пиридина, насыщенного хлористым водородом, нагревали в атмосфере азота 4 часа на песочной бане при 1000 С. По окончании реакции смесь разбавляли водой, получили кверцетин, который идентифицировали хроматографией на бумаге с аутентичным образцом. Следовательно, у вещества 1 в положении 3 находится метильная группа. Непосредственное сравнение вещества 1 хроматографией на бумаге с образцом 3-о-метилкверцетином подтверждает их идентичность. На основании полученных выше данных вещество 1 является 5,7,34-тетраокси-3-метоксифлавонолом, т 3-о-метилкверцетином. Вещество 2. Дает положительную реакцию по Брианту, что указывает на агликоновый характер соединения. Окраска вещества на бумажной хроматограмме в УФ-свете темно-пурпурная, а в парах аммиака - темнокоричневая, что указывает на флавоновую природу. В нейтральном этанольном растворе спектры вещества 2 имеют максимум 1 и 2 полос поглощения 360 и 260 нм. При добавлении ацетата натрия наблюдается гипсохромный сдвиг 2 полосы на 2 нм, что указывает на наличие свободной гидроксильной группы в положении С-7, а наличие 3,4-ортодиоксигруппировки - при добавлении борной кислоты, где этот сдвиг составил 18 нм. На присутствие гидроксильной группы при С-5 говорит батахромный сдвиг 1 полосы на 40 нм с А 1 С 13. При диметилировании вещества 2 получили кемпферол, который идентифицировали хроматографией на бумаге в системах растворителей 1-4 с аутентичным образцом. Следовательно, у вещества 2 в положении 3 находится метильная группа. Непосредственное сравнение вещества 2 с образцом 3-о-метилкемпферолом подтверждает их идентичность. На основании полученных выше данных вещество 2 является 3-ометилкемпферолом. Вещество 3. Дает положительную реакцию, образуя малиновое окрашивание св присутствии НС 1 (конц.). При добавлении октилового спирта продукты восстановления переходят в органический слой, с еС 13 образует грязно-зеленое окрашивание и желтое от ОС 2, которое сохраняется при обработке лимонной кислотой. Эти данные указывают, что вещество 3 является флавоноловым агликоном. В нейтральном этанольном растворе спектры вещества 3 имеют максимум 1 и 2 полос поглощения при 372 и 256 нм. Добавление ацетата натрия вызывает батахромный сдвиг 2 полосы на 19 нм, что свидетельствует о свободной гидроксильной группе в положении С-7. На 2 2612 1 личию гидроксильной группы в положении С-5 характерен батахромный сдвиг 1 полосы на 67 нм с А 1 С 3. 3,4-ортодигидроксильной группировке характерен батахромный сдвиг 1 полосы на 18 нм при добавлении борной кислоты с ацетатом натрия. В случае этилата натрия наблюдается гипсохромный сдвиг 1 полосы на 48 нм. Анализ данных УФ-спектров показал, что вещество 3 имеет свободные гидроксильные группы в 3,5,7,3,4-положениях. Вещество 3 имеет одинаковое значениес аутентичным образцом кверцетина. Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что вещество 3 представляет собой 3,5,7,3,4-пентаоксифлавон (кверцетин). Вещество 4. Повторяет все цветные реакции вещества 3, что указывает на его флавоновую природу. В нейтральном этанольном растворе спектры вещества 4 имеют максимумы 1 и 2 полос поглощения при 353 и 256 нм. При добавлении 3 к этанольному раствору вещества батахромный сдвиг максимума длинноволновой полосы на 32 нм свидетельствует о свободной оксигруппе в положении С-7. Добавление же борной кислоты вызывает этот сдвиг,равный 17 нм, который указывает на наличие 3,4-диоксигруппировок. Батахромный сдвиг длинноволнового максимума на 45 нм в присутствии этилата натрия указывает на наличие свободной оксигруппы в положении С-4. Анализ данных УФ-спектров показал, что вещество 4 имеет свободные гидроксильные группы в положениях 5,7,3,4. Непосредственное сравнение при хроматографии на бумаге вещества 4 с аутентичным образцом лютеолина подтверждают их идентичность и дают основание идентифицировать его с 5,7,3,4 тетраоксифлавоном (лютеолином). Гликозиды Вещество 5. На основании цианидиновой реакции по Брианту (октанол) с образованием водорастворимого флавилиевого пигмента вещество отнесено к флавоноидному гликозиду. Грязно-зеленое окрашивание с 3 и отрицательный результат с 2 свидетельствует о замещении гидроксильной группы в С-3 положении углеводным компонентом. Темно-коричневая флюоресценция вещества 5 на хроматограмме в УФ-свете до проявления может служить предварительным доказательством флавоновой природы гликозида. При кислотном гидролизе вещества 5 получен флавоновый агликон, который на основании хроматографии на бумаге в системах растворителей 1-4 с аутентичным образцом отождествлен с кверцетином. Углеводный компонент гликозида 5 анализировали также методом хроматографии на бумаге и обнаружили одно пятно, которое сравнивали с образцами моносахаридов. Установили, что по значению(0,44 в БУВ 311) и окраске пятна после проявления анилинфталатом он совпадает с -рамнозой. УФ-спектральная характеристика вещества 5 показала наличие свободных гидроксильных групп в положении С-5, С-7, С-3, С-4 и отсутствие свободной гидроксильной группы в положении С-3. Непосредственное сравнение при хроматографии на бумаге вещества 5 с аутентичным образцом подтверждают их идентичность и дают основание идентифицировать его с 5,7,3,4-тетраоксифлавон-3-о-рамнозидом (кверцитрином). Вещество 6. Окрашенные продукты цианидиновой реакции по Брианту не переходят в слой октанола, что указывает на гликозидный характер вещества 6. После обработки хроматограмм 2 образуется ярко-желтая флюоресценция в УФ-свете, характерная для флавоновых соединений. Положение свободных оксигрупп определяли спектральным исследованием в УФ-области с добавлением диагностических реагентов СН 3 СООаН 3 ВО 3 - батахромный сдвиг на 24 нм указывает на наличие 3,4-диоксигруппировок 3 батахромный сдвиг 2 полосы на 6 нм указывает на замещение сахарного компонента при С-7 этилата натрия батахромный сдвиг на 40 нм указывает на наличие свободной оксигруппы в положении С-4. Кислотный гидролиз проходил в жестких условиях, что указывает на возможность присоединения сахарного компонента по С-7. В результате гидролиза получен агликон, который по данным хроматографии на бумаге в системах растворителей 1-4 с аутентичным образцом отождествлен с лютеолином. После обработки анилинфталатным реактивом гидролизата вещества 6 на хроматограмме обнаружили одно пятно, которое по значению(0,24 БУВ 311) и окраске соответствовало аутентичному образцу - -глюкозе. Непосредственное сравнение при хроматографии на бумаге вещества 6 с аутентичным образцом цинарозида подтверждают их идентичность и дают основание идентифицировать его с 5,3,4-триоксифлавон-7-о-глюкозидом (цинарозидом). Вещества 7-10 имели коричневую окраску в УФ-свете, меняющуюся на желтую или бледно-зеленую в парах аммиака, желтую флюоресценцию с А 1 С 13 оранжево-красную с МНС 1, показывали ослабление флюоресценции под действием реактива Бенедикта, т.е. проявляли свойства, характерные для флавоноидов со свободными оксигруппами в положениях 5,3,4, а также имели низкое значение . Компоненты 7-10 располагали двумя сходными максимумами поглощения в УФ-свете - 334 и 270 нм (компоненты 7 и 8), 348 и 270 нм (компоненты 9 и 10). Спектральными исследованиями с применением ионизирующих и комплексообразующих реагентов установлено наличие свободных оксигрупп в положениях 5,7,3,4. Гликозидную природу флавоноидов 7-10 доказали цианидиновой реакцией с октиловым спиртом. Кислотный их гидролиз в 10-ной НС 1 на кипящей водяной бане в течение 6 часов с последующей экстракцией гидролизатов этилацетатом, а потом диэтиловым эфиром дал смесь двух веществ, что установили при хроматографии на бумаге в системах растворителей 1 и 2. Углеводный компонент в гидролизатах веществ 7-10 не обнаружили. Кроме того, вещества 7, 8, 9 и 10 являются изомерными соединениями. При кипячении веществ 8 и 10 в течение 1,5 ч в 5-ной НС 1 образуются соединения, идентифицированные как витексин и ориентин, что является дополнительным доказательством структуры этих веществ. Сравнением хроматографических, химических и спек 3 2612 1 тральных свойств выделенных веществ 7-10 с литературными, а также с аутентичными образцами соединение 7 идентифицировано как витексин, 8 - как сапонаретин (изовитексин), 9 - как ориентин и 10 -гомоориентин (изоориентин). Таким образом, из листьеввыделили и идентифицировали 10 флавоноидных веществ 4 флавонола, 2 флавона и 4 флавон-С-гликозида. Причем 4 последних компонента в семействеобнаружены впервые. Проведены также исследования на содержание биологически активных соединений в нативной ткани бегонии краснолистной. Результаты анализов представлены в таблице 1. Таблица 1 Биологически активные вещества Нативная ткань Полифенолы (мг/) флавонолы 1073,6 лейкоантоцианыантоцианы 1601,6 катехины 436,8 хлорогеновая кислота 195,0 Витамины (мг/) аскорбиновая кислота 7,58 сумма каротиноидов 4,16-каротин 1,58 Углеводыглюкоза 1,75 сахароза 0,88 фруктоза 1,70 пектин растворимый 0,87 протопектин 2,26 Макроэлементы (мг/г) кальций 19,11 магний 11,64 Микроэлементы (мг/кг) железо 142,92 марганец 62,28 цинк 98,39 бор 37,95 хром 1,00 стронций 85,50 медь 9,22 алюминий 382,00 Острую токсичность исследуемого средства определяли в опытах на белых мышах. Препарат вводили внутрь в дозах 1750, 2000 и 2500 мг/кг. Гибели животных не наблюдалось ни в одной из опытных групп, таким образом исследуемый комплекс бегонии краснолистной можно отнести к малотоксичным соединениям. Гипоазотемическая активность предлагаемого средства изучалась в опытах на белых крысах, у которых вызывали острую почечную недостаточность однократным внутримышечным введением 50 раствора глицерина в дозе 10 мл/кг (табл. 2,3), однократным внутрибрюшинным введением дихлорида ртути в дозе 2 мг/кг (табл. 4, 5). Из таблицы 2 следует, что концентрация мочевины в сыворотке крови контрольных животных (группа 1) находилась в пределах 6,8-7,4 мМоль/л. Через сутки после введения глицерина уровень мочевины в сыворотке крови животных с острой почечной недостаточностью ( 2) составил 31,42,6 мМоль/л, а у крыс, получавших исследуемое средство за 1 час до введения глицерина (группа 3) только - 22,31,9 мМоль/л, т.е. по сравнению с интактными животными 1-й группы уровень мочевины возрос в 4,2 раза во 2-й и в 3 раза в 3- . На 4-е сутки течения ОПН данные показатели увеличились во второйв 8 раз, а в третьей остались на том же уровне, и составили 63,06,1 и 21,02,8 мМоль/л соответственно. На 7-е сутки содержание мочевины в сыворотке крови нормализовалось у животных, получавших исследуемый препарат, а у животных второйоставалось повышенным. Таблица 2 Влияние средства из листьев бегонии краснолистной (300 мг/кг, внутрижелудочно) на содержание мочевины в сыворотке крови крыс с глицериновой острой почечной недостаточностью Группа животных 1. Контроль 2. Глицерин 3. Бегонияглицерин 2612 1 Примечание- статистически достоверные изменения (р 0,05) по отношению к контролю, - статистически достоверные изменения (р 0,05) по отношению к 2 . В таблице 3 представлены показатели скорости клубочковой фильтрации (поэндогенного креатинина) у тех же групп животных. Скорость клубочковой фильтрации у интактных животных изменялась в пределах 0,290,36 мл/мин, абсолютная канальцевая реабсорбция - 0,280,34 мл/мин, относительная канальцевая реабсорбция - 91,295,8. В 1-е сутки после введения глицерина у животных 2-й группы, не получавших исследуемое средство, развилась анурическая стадия ОПН т.е. все вышеперечисленные показатели были оценены как нулевые. Введение исследуемого средства животным 3-ей группы предотвратило полное угнетение функции почек, клубочковая фильтрация составила 0,170,03 мл/мин, абсолютная канальцевая реабсорбция 0,160,03 мл/мин, относительная канальцевая реабсорбция 89,61,3. На 4-е сутки развития ОПН функция почек начала восстанавливаться, однако скорость клубочковой фильтрации во 2-йбыла еще очень низкой - 0,060,02, а в 3-ей группе возросла до 0,180,02 мл/мин. Показатели канальцевой реабсорбции имели сходную динамику. В последующие дни течения ОПН все определяемые показатели функциональной деятельности почек нормализовались у животных, которым вводили исследуемое средство, значительно раньше, чем у соответствующего контроля ( группа 2). Таблица 3 средства из листьев бегонии краснолистной (300 мг/кг, внутрижелудочно) на функциональные показатели почек (по клиренсу эндогенного креатинина) у крыс с глицериновой острой почечной недостаточностью Группа животных 1. Контроль 2. Глицерин 3. Бегонияглицерин 1. Контроль 2. Глицерин 3. Бегонияглицерин 1. Контроль 2. Глицерин 3. Бегонияглицерин Дни исследования 4 7 Клубочковая фильтрация (мл/мин) 0,340,06 0,320,06 0,290,04 0 0,060,02 0,220,03 0,170,030,180,020,340,06 Абсолютная канальцевая реабсорбция (мл/мин) 0,340,9 0,290,06 0,280,04 0 0,050,02 0,200,03 0,160,30,160,020,320,06 Относительная канальцевая реабсорбция 94,90,9 91,20,9 95,80,5 0 69,010,5 90,02,6 89,61,388,30,791,32,4 1 Примечание- статистически достоверные изменения (р 0,05) по тношению, - статистически достоверные изменения (р 0,05) по отношению к группе 2 (глицерин). 2612 1 В таблице 4 представлены результаты исследования гипоазотемической активности средства на модели токсической ОПН, вызванной введением дихлорида ртути в дозе 2 /. Так через сутки после введения дихлорида ртути уровень мочевины у животных 2-ой группы повысился в 5 раз по сравнению с интактными животными (группа 1) и составил 26,34,2 мМоль/л. У животных 3-ей группы введение исследуемого средства существенно замедлило нарастание мочевины до 14,4 2,1 мМоль/л. На 4-е сутки содержание мочевины в крови крыс 2-й группы продолжало нарастать и составило 55,63,2 мМоль/л, а в 3-ей группе осталось на том же уровне - 12,17,2 мМоль/л. В этот период наблюдалась и максимальная гибель животных индекс выживаемости составил на 4-е сутки 56 во 2-ой группе и 88 - в 3-ей. Анализ функциональной деятельности почек выявил уже в 1-ые сутки ОПН значительное нарушение клубочковой фильтрации, у животных 2-ой группы клиренс эндогенного креатинина снизился до 0,010,01 мл/мин (табл. 5). У животных 3-ей группы введение исследуемого средства позволило уменьшить повреждающее действие дихлорида ртути, и клиренс эндогенного креатинина составил 0,130,05 мл/мин. Под влиянием исследуемого средства на 4-е сутки течения ОПН показатели клубочковой фильтрации у животных 3-ей группы практически нормализовались и не отличались от показателей интактных животных - 0,180,08 и 0,270,08 мл/мин, а у животных 2-ой группы функция почек оставалась очень низкой, клиренс эндогенного креатинина составил 0,040,02 мл/мин. В доступной литературе сведений о нормализации азотного обмена к 4-м суткам ОПН нами не обнаружено, таким образом исследуемое средство обладает мощным гипоазотемическим действием. Таблица 4 средства из листьев бегонии краснолистной (300 мг/кг, внутрижелудочно) на концентрацию мочевины (мМоль/л, 811) в сыворотке крови у крыс с острой почечной недостаточностью, вы званной введением ртути дихлорида ( 2 мг/кг) Группа животных Дни исследования 1 4 1. Контроль 4,20,4 5,80,6 2. Ртути дихлорид 26,34,2 55,63,2 3. Бегонияртути дихлорид 14,42,112,77,2 Примечание- статистически достоверные изменения (р 0,05) по тношению, - статистически достоверные изменения (р 0,05) по отношению к группе 2 (ртути дихлорид). Таблица 5 Влияние средства из листьев бегонии краснолистной (300 мг/кг, внутрижелудочно) на фильтрационную функцию почек (по клиренсу эндогенного креатинина) (мл/мин, 68) у крыс с острой почечной не достаточностью, вызванной введением ртути дихлорида (2 мк/кг, внутрибрюшинно) Группа животных 1. Контроль 2. Ртути дихлорид 3. Бегонияртути дихлорид Примечание- статистически достоверные изменения (р 0,05) по тношению, - статистически достоверные изменения (р 0,05) по отношению к группе 2 (ртути дихлорид). Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.