Ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят и способ ее получения

12 7/00, 61 1/00 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА И РОТАВИРУСНОЙ БОЛЕЗНИ ПОРОСЯТ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского(72) Авторы Ястребов Аскалон Сергеевич Ковалев Николай Андреевич Савельева Тамара Александровна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского(57) 1. Ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят, включающая культуральную вируссодержащую суспензию корона- и ротавируса свиней и наполнитель, отличающаяся тем, что в качестве культуральной вируссодержащей суспензии она содержит суспензию штамма вирусаКМИЭВ-10 с титром в культуре клеток СПЭВ 6,5 ТЦД 50/мл и суспензию штаммаКМИЭВ-11 с титром 7,5 ТЦД 50/мл в соотношении 21, а в качестве наполнителя - адъювант эмульсиген при следующем соотношении компонентов, об.культуральная вируссодержащая суспензия 80,0-90,0 наполнитель 10,0-20,0 2. Способ получения ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят, включающий заражение культуры клеток вирусами, культивирование и сбор вируссодержащего материала, введение наполнителя, отличающийся тем, что заражение культуры клеток проводят вирусом трансмиссивного гастроэнтерита КМИЭВ-10 с титром 6,5 ТЦД 50/мл и ротавирусом свиней КМИЭВ-11 с титром 7,5 ТЦД 50/мл, в качестве культуры клеток используют перевиваемую культуру клеток СПЭВ с множественностью заражения 0,3-0,4 тканевых цитопатогенных доз (ТЦД 50) на клетку, культивирование проводят на 5 -ном гемогидролизате, полученные суспензии вируса трансмиссивного гастроэнтерита КМИЭВ-10 и ротавируса свиней КМИЭВ-11 смешивают в соотношении 21, а в качестве наполнителя используют адъювант эмульсиген, причем его вводят в количестве 15 об.от общего объема получаемой ассоциированной вакцины.(56) АЛИПЕР Т.И. Экспериментальная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней (ТР-) оценка антигенности и оптимизация условий применения. - М., 1989. - С. 1-24.2028804 1, 1995.2055889 1, 1992. 5081 1 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано для профилактики вирусных гастроэнтеритов поросят. Известна инактивированная эмульгированная культуральная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), изготовленная во Всероссийском НИИ защиты животных (г. Владимир), взятая нами за прототип 1. В качестве антигена используют инактивированный вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней, полученный на культуре клеток, к которому добавляют масляный адъювант. Недостатком вакцины является то, что перед применением ее необходимо предварительно прогревать до 37 С. Кроме того, трансмиссивный гастроэнтерит в свиноводческих хозяйствах часто протекает в ассоциации с ротавирусным гастроэнтеритом. В этой связи возникает необходимость проведения специфической профилактики не только против трансмиссивного гастроэнтерита,но и против ротавирусной болезни свиней. Вакцина по прототипу 1 создает иммунитет у привитых животных только к возбудителю трансмиссивного гастроэнтерита и не создает его к ротавирусной болезни свиней. Известен способ изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней, взятой нами за прототип 2. Вирусы трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней выращивают на перевиваемой культуре клеток почки поросенка или щитовидной железы. В качестве ростовой среды используют солевой раствор Хенкса с 0,2-0,3 ФГМ-с и 7-10 коммерческой сыворотки крупного рогатого скота. Готовят 2 вида набора вакцин 1) живую вакцину, содержащую смесь в равных объемах аттенуированных штаммов вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса свиней 2) инактивированную формалином вакцину, содержащую смесь равных объемов вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни с адъювантом, состоящим из минерального масла и ланолина в соотношении 41. Способ применения вакцины комбинированной живую вакцину в дозе 3.106,5 ТЦД 50 вводят свиноматкам интранозально, инактивированную -внутримышечно в дозе 3,0 см 3. Недостатком способа получения вакцины по прототипу 2 является необходимость приготовления набора из двух видов вакцин (живой и инактивированной), одна из которых вводится свиноматкам интранозально. Введение вакцины таким способом связано с определенными трудностями, возникающими при фиксации глубоко супоросных свиноматок, использование дорогостоящих и дефицитных компонентов для получения вакцины и определенная потенциальная опасность реверсии аттенуированных вирусов и их рассеивания в окружающей среде. Предлагаемый способ приготовления ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят, включающий заражение культуры клеток вирусами, культивирование и сбор вируссодержащего материала, введение наполнителя, отличающийся тем, что заражение культуры клеток проводят вирусом трансмиссивного гастроэнтерита КМИЭВ-10 с титром 6,5 ТЦД 50/мл и ротавирусом свиней КМИЭВ-11 с титром 7,5 ТЦД 50/мл, в качестве культуры клеток используют перевиваемую культуру клеток СПЭВ. С целью определения оптимальной дозы вирусов для заражения культуры клеток(множественности заражения) провели опыт. В матрасы с культурой клеток вносили вирус трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирус свиней с множественностью заражения 0,2 0,3 0,4 0,5 тканевых цитопатогенных доз вируса (ТЦД 50) на клетку. Использовали по 3 матраса на каждую дозу заражения вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса свиней (множественность заражения), выраженную в ТЦД 50/мл. Всего использовали 28 матрасов с культурой клеток, в т.ч. 4 контрольных (не зараженных вирусами). Через 24, 48, 72, 96 часов по 1 матрасу снимали с инкубирования, трехкратно замораживали и оттаивали, отбирали пробы культуральной вируссодержащей жидкости и титровали их на культуре клеток СПЭВ. Результаты титрования вирусов приведены в табл. 1. 2 5081 1 Таблица 1 Влияние множественности заражения вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса свиней на их накопление в культуре клеток Множественность Инфекционный титр вируса ( ТЦД 50/см 3 через, часы) заражения, ТЦД 50 24 48 72 96 на клетку Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней 0,2 3,00,05 4,850,13 5,750,13 6,250,04 0,3 3,720,90 5,910,11 6,350,08 6,10,21 0,4 3,750,02 6,00,07 6,50,05 6,120,29 0,5 3,250,04 5,250,16 5,940,03 5,750,09 Ротавирус свиней 0,2 2,980,04 5,670,15 6,50,19 0,3 3,1 50,06 7, 120,25 7,10,13 0,4 3,20,03 7,20,29 7,010,21 0,5 3,50,12 7,10,19 7,050,17 Из табл. 1 видно, что при множественности заражения 0,3-0,4 ТЦД 50 вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса на клетку инфекционная активность вируса трансмиссивного гастроэнтерита достигала максимального значения через 72 часа после заражения и составляла 6,350,08 - 6,50,05 ТЦД 50/см 3, ротавируса - через 48 часов после заражения и составляла 7,120,25 - 7,20,29 ТЦД 50/см 3. При множественности заражения вирусов 0,2 и 0,5 ТЦД 50 титр вируса трансмиссивного гастроэнтерита в эти сроки составлял соответственно 5,750,13 и 5,940,03, ротавируса 5,670,15 и 7,10,19 ТЦД 50/СМ 3. Таким образом, оптимальной дозой заражения культуры клеток СПЭВ вирусом трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусом свиней является множественность заражения 0,3-0,4 ТЦД 50 вирусов на клетку. Уменьшение множественности заражения вирусов на клетку приводит к снижению их накопления в культуре клеток. Повышение дозы вирусов до 0,5 ТЦД 50 на клетку существенно не влияло на их накопление. Матрасы с культурой клеток СПЭВ, инфицированной ротавирусом, снимают в заморозку на 2-ой день после заражения, вирусом трансмиссивного гастроэнтерита - через 3-ое суток после заражения при наличии выраженного цитопатогенного действия вирусов. Матрасы с инфицированной культурой клеток трехкратно замораживают и оттаивают, полученную культуральную вируссодержащую жидкость сливают в 1,5-литровые матрасы. Для определения инфекционной активности вирусов отбирают пробы культуральной жидкости для титрования на культуре клеток СПЭВ. В культуральную жидкость, содержащую вирус трансмиссивного гастроэнтерита, вносят 0,1 формалина по объему, содержащую ротавирус - 0,3 формалина. Культуральную вируссодержащую жидкость выдерживают при 37 С в течение 24 часов. По окончании этого срока отбирают образцы(по 5 мл) инактивированных вирусов на стерильность и полноту инактивации. Для определения стерильности образцы культуральной вируссодержащей жидкости высевают в пробирки с питательными средами МПА, МПБ, среда Китт-Тароцци и среда Сабуро (по 4 пробирки). В течение 10 дней просматривают среды на присутствие микроорганизмов и грибов. Контроль полноты инактивации вирусов формалином проводят путем внесения в пробирки с культуры клеток СПЭВ инактивированных вирусов (по 0,2 мл на пробирку). Материалы каждой культуральной вируссодержащей суспензии заражают не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Зараженную культуру клеток инкубируют в термостате при 37 С и ежедневно в течение 4-х суток учитывают результаты. При полной инактивации вирусов отсутствует их цитопатогенное действие в первом и последующих 1-2-х пассажей материала. 3 5081 1 В случае обнаружения цитапатического действия вируса трансмиссивного гастроэнтерита или ротавирусной болезни во втором или третьем пассажах материала, матрас, из которого была взята проба, отправляют на повторную инактивацию. Для этого в вируссодержащую суспензию вносят формалин, как описано выше, и инкубируют при 37 С в течение 12-24 часов при периодическом помешивании. В следующем опыте определяли оптимальное соотношение вирусных компонентов вакцины и наполнителя. Опыт проводили на 5 свиноматках крупной белой породы в возрасте 2-3 лет. Схема опыта изложена в табл. 2. Результаты опыта учитывали по титрам антител к вирусу ТГС и ротавирусу при их различных соотношениях в вакцине. Таблица 2 Компоненты вакцины Инактивированный вирус Инактивированный ротавирус Адъювант эмульсип/п ТГС,свиней,ген,Опыт 1. 45 45 10 2. 60 30 10 3. 56,7 28,3 15 4. 53,4 26,6 20 Контроль 40(минеральное 5. 40 20 масло) Готовили 5 образцов вакцины 1 (соотношение вирусных компонентов в вакцине 11, 10 адъюванта эмульсигена),2, 3, 4, 5 (соотношение вируса ТГС и ротавируса 21, 10, 15 и 20 эмульсигена). В 5-ом варианте вакцины соотношение вирусных компонентов составляло 21, в качестве адъюванта использовали 40 минерального масла. Все 5 образцов вакцины вводили животным внутримышечно двукратно 1-ый раз за 6 недель до опороса в объеме 6,0 мл, через 3 недели после 1-ой инъекции - 7,0 мл, через 21 день после второго введения вакцины у свиноматок брали пробы крови, сыворотки крови исследовали в РНГА на антитела к вирусу ТГС и в РТГА - на антитела к ротавирусу свиней. Оптимальным считали тот вариант вакцины, после введения которой у животных отмечали накопление максимальных титров антител к вирусам. По величине титров судим об антигенной активности вакцины. Результаты исследования приведены в табл. 3. Таблица 3 Определение оптимального соотношения компонентов вакцины Компоненты вакцины,Титры антител (лог 2) к ИнактивированИнактивированАдъювант п/п ный ротавирус вирусу ТГС ротавирусу ный вирус ТГС эмульсиген свиней Опыт 1. 45 45 10 4,30,3 7,10,42 2. 60 30 10 7,50,14 8,60,19 3. 56,7 28,3 15 9,80,14 10,60,15 53,4 26,6 20 Р 0,001 Р 0,001 4. 10,00,48 10,80,17 Контроль 405. 40 20 5081 1 Из табл. 3 видно, что соотношение вирусных в вакцине вируса ТГС и ротавируса 21 является оптимальным. Титр антител к вирусу ТГС составил 9,80,14, ротавирусу 10,60,15 при концентрации адъюванта эмульсигена 15 . Повышение в вакцине концентрации адъюванта до 20 приводит к некоторому повышению титра антител, однако практически он не отличался от уровня антител в варианте вакцины, где его концентрация составляла 15 . При соотношении вируса ТГС и ротавируса 11 отмечен невысокий уровень антител к вирусу ТГС (4,30,30) по сравнению с вариантами вакцины, где соотношение вирусов составляло 21. После введения свиноматкам известной вакцины, где в качестве адъюванта использовали минеральное масло, титр антител к вирусу ТГС на 21-ый день после 2-ой вакцинации составлял 6,50,17, к ротавирусу - 7,30,60. Полученные данные дают основание утверждать, что оптимальным соотношением вируса ТГС и ротавируса в заявленной вакцине является соотношение вируса ТГС и ротавируса 21, соотношение вирусных компонентов и наполнителя - 85 и 15 соответственно. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят обладает выраженной антигенной активностью. Компоненты вакцины не дефицитны и сравнительно не дорогие. Культуру клеток СПЭВ выращивают на питательной среде - 5 -ном гемогидролизате,который в 4 раза дешевле питательной среды для культуры клеток 199. Полученные культуральные, содержащие вирус трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирус свиней, суспензии объединяют в соотношении 21 соответственно. Полученную вирусную суспензию сливают в стерильную бутыль емкостью 5-10 л, вносят адъювант эмульсиген в концентрации 15 к объему вирусной суспензии, тщательно перемешивают. Определяют рН и при необходимости доводят его до цифры 7,2-7,4 с помощью 1 Н. После проверки на стерильность вакцину фасуют в стерильные флаконы объемом 200,0 или 400,0 см 3, укупоривают стерильными резиновыми пробками, закатывают алюминиевыми колпачками. На каждый флакон наклеивают этикетку. Колостральные антитела к вирусу ТГС и ротавирусу свиней, получаемые поросятами с молозивом привитых вакциной свиноматок, защищают их от трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни. В 1996 г. вакцина прошла производственное испытание в 5 свиноводческих хозяйствах, неблагополучных по вирусным гастроэнтеритам поросят. В производственном опыте вакцина защищала 92,3 поросят от заболевания трансмиссивным гастроэнтеритом и ротавирусной болезнью. Источники информации 1. Инактивированная эмульгированная культуральная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней. ТУ 08064-19-42-95. - Владимир, 1995. - С. 19. 2. Алипер Т.И. Экспериментальная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней (ТР-1) оценка эффективности и оптимизация условий применения / Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидат ветнаук. - М., 1989. С. 1-24. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.