Штамм avian influenza virus КМИЭВ-V107 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Гусев Анатолий Алексеевич Згировская Алла Александровна Азарова Ирина Андреевна Ломако Юрий Васильевич Насонов Игорь Викторович Минчук Юлия Николаевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56) ФРОЛОВ С.В. и др. // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Т. . - Владимир, 2007. С. 119-130.2323740 1, 2008.2346982 1, 2009.2361917 1, 2009. БОРИСОВ А.В.др. // Ветеринария. 2008. -6. - С. 14-17. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии, и может быть использовано для создания вакцин с высокой иммуногенностью. Известен штамм вируса 51 Новосибирский, который культивируется на 9-10 суточных СПФ-эмбрионах, его биологическая активность составляет 109,0 ЭИД 50/см 3, гемагглютинирующая активность - 64 2 1. Этот штамм является производственным, его используют для производства вакцины против гриппа птиц подтипа 5. Недостатком данного штамма является его высокая вирулентность, что приводит к гибели эмбрионов и уменьшению количества экстраэмбриональной жидкости, отбираемой у эмбриона, соответственно, и объема вакцины. Известен штамм вируса гриппа птиц подтипа 52 Приморский, относящийся к семейству , вирионы плеоморфной, чаще округлой формы, диаметром 80120 нм. Штамм культивируется на 9-10-дневных эмбрионах кур, не вызывая их гибели в течение 72-часовой инкубации при 37 С. При введении восприимчивым птицам вызывает образование напряженного иммунитета. Биологическая активность вируса 108,0 ЭИД 50/мл. Вирус штамма Приморский способен агглютинировать эритроциты птиц, морских свинок, кроликов, лошадей, овец и других животных, гемагглютинирующий титр 1128 2. Недостатком данного штамма является его низкая биологическая активность. 16221 1 2012.08.30 Задачей настоящего изобретения является селекция выделенного ранее штаммаКМИЭВ-107, обладающего биологической активностью и высокой иммуногенностью, который может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-антигена был селекционирован штаммКМИЭВ-107 - штамм-антиген, обладающий высокой биологической активностью и высокой иммуногенностью. ШтаммКМИЭВ-107 депонирован в коллекции микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского. Коллекционный номер КМИЭВ-107. Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству ,род . . Это РНК-содержащий вирус, состоящий из негативного фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии. Культурально-морфологические признаки. Вирус культивируется на 9-10-суточных СПФ-куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную или амниотическую полость. Вирус агглютинирует эритроциты кур, морских свинок, кроликов, лошадей, овец. Инфекционный титр вируса на СПФ-куриных эмбрионах составляет 8,5 ЭИД 50/см 3, гемагглютинирующий титр - 7,0-8,0 2. Морфологические признаки. РНК-содержащий вирус. Форма вириона близка к сферической с диаметром частиц 80-120 нм. Вирус состоит из фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы двух видов. Негативный геном состоит из 8 фрагментов, каждый из которых кодирует определенный белок. Выступы 1-го вида образованы гемагглютинином(НА). Выделено 15 подтипов гемагглютинина. Выступы 2-го типа образованы нейраминидазой . Установлено 9 подтипов нейраминидазы. Физико-биохимические свойства. Инактивируется формальдегидом, детергентами,гидроксиламином, кислотами. При 55 С инактивируется в течение 1 часа, при 60 С - в течение 10 минут. При низких температурах и в лиофилизированном состоянии сохраняется до 2 лет. Молекулярно-биологические признаки. РНК вируса гриппа несет в себе информацию о 8 структурных и 2 неструктурных белках (один ген кодирует один или два белка). Это полимеразные белки РВ 1, РВ 2, РВ 3, поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидаза, нуклеопротеид - , мембранные белки -и неструктурные белки - . Гены, кодирующие поверхностные белки, обладают наибольшей изменчивостью,остальные же относительно консервативны. Вирус состоит из двух слоев мембраны с заключенным в них нуклеокапсидом. Основой нуклеокапсида является рибонуклеопротеид, включающий вирусную РНК, белоки 3 белка полимеразного комплекса. Полипептиднесет в себе антигенные детерминанты, определяющие типовую принадлежность штамма. Белки полимеразного комплекса связаны с нуклеокапсидом и осуществляют синтез всех типов РНК в новой популяции вирионов.-белок является типоспецифичным. Он в виде непрерывного молекулярного слоя примыкает к наружной мембране, определяя структурную организацию последней. Мембранные белки функционируют как ионные насосы, регулируя уровень кислотности. Неструктурные белки 1 и 2 вырабатываются вирусом гриппа в организме хозяина и препятствуют выработке клетками интерферона. Гемагглютинин отвечает за прикрепление вируса к поверхности клетки хозяина, нейраминидаза, осуществляя ферментативную реакцию, способствует проникновению вируса внутрь клетки хозяина и выходу вновь образовавшихся вирионов либо приводит к элюции вируса с клеточной мембраной. Предполагается, что активность нейраминидазы помогает вирусным частицам проникать через секреты слизистых оболочек, богатых сиаловой кис 2 16221 1 2012.08.30 лотой. Таким образом, вирионы быстро достигают клеток-мишеней эпителия дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта. Маркерные признаки. Гемагглютинин и нейраминидаза относятся к полипептидам с высокой иммуногенной активностью. Гемагглютинин стимулирует синтез в организме антител, нейтрализующих инфекционную активность вируса и тормозящих реакцию гемагглютинации. В экспериментальных условиях специфические антитела можно получить на кроликах, крысах и морских свинках. Нейраминидаза по антигенной значимости является вторым после гемагглютинина вирусспецифическим полипептидом. Его изменчивость сопровождается появлением новых эпизоотически и эпидемически значимых штаммов вируса гриппа типа . Онкогенность. Штамм вируса КМИЭВ-107 не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса КМИЭВ-107 не контаминирован. Антигенная активность. Антигенная активность составляет не ниже 6,0 2 в РТГА у 85 привитых цыплят. Биологическая активность составляет не ниже 108,5 ЭИД 50/см 3. Безвредность. Штамм вируса КМИЭВ-107 непатогенен для цыплят. Вирулентность. Штамм вируса КМИЭВ-107 невирулентен. Иммуногенность. Иммуногенность штамма вируса КМИЭВ-107 составляет не менее 85 . Чувствительность к антибиотикам. Вирус резистентен к действию антибиотиков. Способы и условия хранения. Хранят в сухом лиофилизированном состоянии при температуре не выше 40 С в течение 5 лет. Жизнеспособность его поддерживается путем пассажа на СПФ-эмбрионах кур. Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде или при температуре не выше минус 20 С. Пример 1 ВыделениеКМИЭВ-107. ШтаммКМИЭВ-107 выделяли на 9-10-суточных СПФэмбрионах кур, которых заражали надосадочной жидкостью, полученной после обработки патологического материала, отобранного от птиц. Заражение проводили на хорионаллантоисную оболочку. Эмбрионы инкубировали в течение 72-96 часов при 37 С с ежедневным овоскопированием, после чего производили отбор экстраэмбриональной жидкости. Экстраэмбриональную жидкость проверяли на гемагглютинирующую активность вируса в реакции гемагглютинации (РГА) на предметном стекле. При отсутствии гемагглютинации в РГА проводили 3-5 слепых пассажей на эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов. Пробу исследуемого материала считать положительной, если в 3-5 пассажах обнаруживали гемагглютинацию эритроцитов или патогенное действие вируса (гибель эмбрионов) Пример 2 Культивирование штаммаКМИЭВ-107 в СПФ куриных эмбрионах. ШтаммКМИЭВ-107 культивировали на 9-10-суточных СПФэмбрионах кур. Эмбрионы заражали 103 эмбриональных инфекционных доз (ЭИД 50/0,1 см 3) вируса с 20 мкг трипсина (, Т 1426) на хорионаллантоисную оболочку. Эмбрионы инкубировали в течение 72-96 часов при 37 С с ежедневным овоскопированием. Затем эмбрионы вскрывали, отбирали экстраэмбриональную жидкость и проверяли ее в реакции гемагглютинации. В случае размножения вируса в куриных эмбрионах полученная экстраэмбриональная жидкость должна агглютинировать эритроциты кур. Установлено наличие размножения вируса в эмбрионах, что подтверждается гемагглютинацией эритроцитов кур (реакция положительная), титр составлял 1256 (8,0 2). 3 16221 1 2012.08.30 Пример 3 Определение биологической активности штаммаКМИЭВ-107. Биологическую активность штаммаКМИЭВ-107 определяли титрованием на развивающихся эмбрионах кур 9-10-дневной инкубации. Лиофильно высушенный вирус растворяли стерильным водным раствором натрия хлорида с массовой долей 0,9( 7,2) в объеме, равном объему вируса до сушки. Из полученной пробы готовили разведения от 10-1 до 10-9 на стерильном водном растворе натрия хлорида с массовой долей 0,9( 7,2). Перед заражением скорлупу яйца в области воздушной камеры протирали спиртовым растворомс массовой долей йода 5 и фламбировали. Каждым разведением вируса, начиная с 10-9, заражали по 4 эмбриона в ХАО в объеме 0,1 см 3. В качестве контроля оставляли 4 эмбриона, которых не заражали. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заклеивали парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в течение 72-96 часов при (371) С и относительной влажности 60-70 . Овоскопию эмбрионов проводили 2 раза в сутки. Эмбрионы, павшие в течение 24 часов после заражения, уничтожали, считая их гибель неспецифической. По истечению срока инкубации все эмбрионы вскрывали (в том числе и павшие), отбирали экстраэмбриональную жидкость и исследовали ее в капельной реакции гемагглютинации (РГА) с 1 -ным раствором куриных эритроцитов. Учет результатов титрования проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина. Биологическая активность штаммаКМИЭВ-107 составляла 108,5 ЭИД 50/см 3. Пример 4 Определение иммуногенной активности штаммаКМИЭВ-107. Иммуногенную активность штаммаКМИЭВ-107 проверяли путем заражения цыплят 8-10-суточного возраста. С этой целью были сформированы опытная группа цыплят и контрольная, по 20 голов в каждой. Цыплят опытной группы иммунизировали внутримышечно по 0,5 см 3 в область грудной мышцы штаммомКМИЭВ-107. Контролем служила группа цыплят такого же возраста, которым вводили аналогичным способом плацебо (физиологический раствор). До иммунизации (фон), а затем после нее на 14, 21 и 28 сутки у всех цыплят были отобраны пробы крови, сыворотку которой исследовали в РТГА. Об иммуногенности штаммаКМИЭВ-107 судили по нарастанию титров специфических антител в сыворотках крови кур. Для определения титров использовали набор для лабораторной диагностики гриппа птиц (на 13 серотипов гемагглютинина) в РТГА. Результаты изучения иммуногенной активности штаммаКМИЭВ-107 представлены в таблице. Антигенная активность штаммаКМИЭВ-107 в РТГА Штамм вируса фон 28-е сутки Штамм 0 2,0 6,0 7,0 КМИЭВ-107 Как видно из таблицы, введение штаммаКМИЭВ-107 цыплятам приводило к нарастанию титров антител в сыворотках крови с 2,0 до 7,0 2. Таким образом, штаммКМИЭВ-107 обладает, по сравнению с прототипом, более высокой биологической активностью 108,5 ЭИД 50/см 3 и может быть использован для изготовления вакцины в качестве штамма-антигена с высокими иммуногенными свойствами. 16221 1 2012.08.30 Источники информации 1. Штамм для изготовления инактивированной вакцины против гриппа птиц (описание антигенных и биологических свойств) / С.В.Фролов, Т.Б.Манин, И.П.Пчелкина и др. // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Том . С. 119-130. 2. Эффективность инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5