Штамм вируса Newcastle disease КМИЭВ-36 – штамм-антиген

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(72) Авторы Бирман Борис Яковлевич Насонов Игорь Викторович Азарова Ирина Андреевна Згировская Алла Александровна Падерова Инна Ивановна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(56)826584, 1982.2259844 1, 2005. БИРМАН Б.Я. и др. Эпизоотология,иммунология, фармакология и санитария. - 2005. -1. - С. 76-79. ПРУДНИКОВ А.В. и др. Эпизоотология, иммунология, фармакология и санитария. - 2004. -1. - С. 21-23. БИРМАН Б.Я. и др. Международная научно-практическая конференция Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных. - Минск,2003. - С. 58-61. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии, и касается штамма, выделенного из патологического материала голубя, больного ньюкаслской болезнью и депонированного в коллекции культур микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского, обладающего высокой биологической активностью, и может быть использовано для создания вакцин с высокой иммуногенностью. Известен штамм вируса ньюкаслской болезни Бор-74 ВГНКИ, относящийся к семейству , вирионы нитевидной, ракетковидной, сферической и полиморфной форм размером от 90 до 150 нм. Штамм культивируется на 9-10-дневных эмбрионах кур, не вызывая их гибели в течение 96-часовой инкубации при 37 С, термостабилен. При введении восприимчивым птицам вызывает образование напряженного иммунитета против эпизоотического вируса ньюкаслской болезни. Биологическая активность вируса 108,5109,75 ЭИД 50/мл. Вирус штамма Бор-74 ВГНКИ способен агглютинировать эритроциты птиц и животных, гемагглютинирующий титр 1512 1. Недостатком данного штамма является его низкая биологическая активность. 12749 1 2009.12.30 Известен штамм вируса ньюкаслской болезни Ла-Сота, который культивируется на 910-суточных СПФ-эмбрионах, его биологическая активность составляет 109,7 ЭИД 50/см 3,гемагглютинирующая активность - 1512 2. Недостатком данного штамма является также низкая биологическая активность. Задачей настоящего изобретения является выделение штамма вируса ньюкаслской болезни ( ) с более высокой биологической активностью, что позволит создавать вакцины с высокой иммуногенностью. Поставленная цель достигается тем, что штамм вируса(ньюкаслской болезни птиц) - штамм-антиген - был выделен в 2003 году из патологического материала от больного голубя. Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству Раа, род. Это РНК-содержащий вирус. Содержит линейный геном, представленный минус-нитью РНК в виде единой молекулы. Культурально-морфологические признаки. Культивируется на куриных эмбрионах 910-суточной инкубации при любом способе заражения или на фибробластах эмбрионов кур. Максимальное накопление вируса наблюдается через 96-120 часов. Вирус агглютинирует эритроциты амфибий, рептилий, птиц, человека, мыши и морской свинки. Морфологические признаки. Размер вирионов от 120 до 300 нм. Оболочка имеет выступы или нити длиной 8 нм и содержит антигенные компоненты. Внутренний компонент нуклеокапсид (-антиген) - представляет собой длинную заостренную трубку диаметром 13 нм. Структурные единицы протеина этой трубки (капсомеры) расположены по спирали вокруг центральной оси, внутри них находится РНК. Физико-биохимические свойства. Устойчив к эфиру, хлороформу, устойчив при диапазоне рН 2,0-10,0, при температуре 56 С сохраняется 5 ч, при 60 С - 30 мин, а при 30 С в присутствии 0,5 фенола или 0,125 мертиолята - в течение 1 ч. При воздействии 0,5 раствора формалина инактивируется за 6 ч. Чувствителен к ультразвуку. Молекулярно-биологические признаки. Вирион содержит 6 полипептидов , , М и полипептид с молекулярной массой 47000 Д. В составе вируса имеются 3 основных и 5 минорных белковых компонентов. К основным относятся гемагглютинин, белок внутренней оболочки и белок РНП. Нейраминидаза является одним из минорных компонентов. Кроме этого, в вирионе обнаружена эндорибонуклеаза. Маркерные признаки. Вирионы шт. КМИЭВ-36 содержат(гемагглютинин и нейраминидазу) и(РНП) антигены, различающиеся по локализации в вирионе, иммуногенности и антигенной активности. -антиген обладает высокой гемагглютинирующей активностью, выраженной антигенностью и иммуногенностью. Инфекционная и гемолитическая активность не выявлена. Серологический вариант -1. Онкогенность. Штамм вирусаКМИЭВ-36 не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вирусане контаминирован. Антигенная активность. Антигенная активность составляет не ниже 4,0 2 в РТГА у 85 привитых цыплят. Биологическая активность составляет не ниже 109,8 ЭИД 50/см 3. Безвредность. Штамм вируса ньюкаслской болезни КМИЭВ-36 не патогенен для цыплят. Вирулентность. Штамм вирусаКМИЭВ-36 не вирулентен. Иммуногенность. Иммуногенность штамма вирусаКМИЭВ-36 составляет не менее 85 . Чувствительность к антибиотикам. Вирус резистентен к действию антибиотиков. Способы и условия хранения. Хранят при 2 4 С после лиофильного высушивания в защитной среде в течение 5 лет. Жизнеспособность его поддерживается путем пассажа на эмбрионах кур. 12749 1 2009.12.30 Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде при температуре 2 4 С или в морозильнике при - 20 С. Пример 1. Пример выделения штамма вирусаКМИЭВ-36. Штамм выделяли из патологического материала (паренхиматозные органы, головной мозг) дикого голубя методом заражения развивающихся куриных эмбрионов 9-10-суточного возраста по 0,1 см 3 в хорионаллантоисную оболочку (ХАО). Эмбрионы инкубировали в течение 96-120 ч при 37 С с ежедневным овоскопированием. Затем эмбрионы вскрывали, отбирали экстраэмбриональную жидкость и проверяли ее в реакции гемагглютинации. Пример 2. Пример подтверждения, что выделенный агент является вирусом ньюкаслской болезни ( ). Для определения, что выделенный агент является вирусом, суспензией из органов дикого голубя заражали 9-10-суточных эмбрионов по стандартной методике. Эмбрионы инкубировали 120 ч, после чего отбирали экстраэмбриональную жидкость и проверяли ее в реакции гемагглютинации. В случае размножения вируса в данной биологической модели реакция гемагглютинации должна быть положительной. Установлено наличие размножения вируса в эмбрионах, что подтверждается гемагглютинацией эритроцитов кур (реакция положительная). Идентификацию выделенного вируса проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с положительной сывороткой к вирусу ньюкаслской болезни (титр антител в сыворотке - 1512). Установлено, что титр выделенного вируса в РТГА составлял 1128, что свидетельствует о том, что выделенный возбудитель принадлежит к вирусу ньюкаслской болезни. Пример 3. Пример определения биологической активности штамма КМИЭВ-36. Биологическую активность определяли титрованием на развивающихся эмбрионах кур 9-10-дневной инкубации. Лиофильно высушенный вирус растворяли стерильным водным раствором натрия хлорида с массовой долей 0,9(рН 7,2) в объеме, равном объему до сушки. Из полученной пробы готовили разведения от 10-1 до 10-11 на стерильном водном растворе натрия хлорида с массовой долей 0,9(рН 7,2). Перед заражением скорлупу яйца в области воздушной камеры протирали спиртовым раствором с массовой долей йода 5 и фламбировали. Каждым разведением вируса, начиная с 10-11, заражали по 4 эмбриона в ХАО в объеме 0,2 см 3. В качестве контроля оставляли 4 эмбриона, которых не заражали. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заклеивали парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в течение 96-120 ч при (37-38) С и относительной влажности 60-70 . Овоскопию эмбрионов проводили 2 раза в сутки. Эмбрионы, павшие в первые 24 ч после заражения, уничтожали, считая их гибель неспецифической. По истечению срока инкубации все эмбрионы вскрывали (в том числе и павшие), отбирали экстраэмбриональную жидкость и исследовали ее в капельной реакции гемагглютинации(РГА) с 1 -ным раствором куриных эритроцитов. Учет результатов титрования проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина. Биологическая активность вируса составляла 109,8 ЭИД 50/см 3. Определение гемагглютинирующей активности штамма вирусаКМИЭВ-36 показало, что титр гемагглютинации составлял не менее 1512. Пример 4. Пример определения вирусной контаминации. Контаминацию посторонними вирусами определяли на 10 цыплятах 15-20-суточного возраста. Для этого каждому цыпленку вводили внутримышечно по 100 50/0,2 см 3 вируса в объеме 0,2 см 3. Через 14 суток вирус вводили повторно. Пять цыплят оставляли в качестве контроля. Через 21 день после второго введения вируса производили забор крови с целью получения сыворотки, которую 3 12749 1 2009.12.30 исследовали в ИФА тест-наборами, на наличие специфических антител к различным вирусам (вирусу инфекционного бронхита кур, вирусу инфекционной бурсальной болезни,вирусу гриппа птиц). Проведенные исследования показали, что в пробах сывороток крови не обнаружено антител к вирусам инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни,гриппа птиц. Таким образом, штамм вирусаКМИЭВ-36 обладает по сравнению с прототипом более высокой биологической активностью 109,8 ЭИД 50/см 3 и может быть использован для изготовления вакцины в качестве штамма-антигена с высокими иммуногенными свойствами. Источники информации 1. А.с. СССР 826584, МПК 3 А 61 39/17, 1982. 2. Патент России 2259844, МПК 7 А 61 39/17, А 61 31/12, 2005 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4