Штамм Avibirnavirus bursitis infectiosa gallinae – штамм-антиген

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(72) Авторы Бирман Борис Яковлевич Насонов Игорь Викторович Захарик Николай Владимирович Полоз Светлана Васильевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии, и касается штамма, выделенного от цыплят больных инфекционной бурсальной болезнью(ИББ), обладающего высокой иммуногенностью, и может быть использовано для конструирования диагностических и профилактических препаратов при данном заболевании. Известно использование штамма вируса инфекционной бурсальной болезни Си-1, который был выделен в культуре клеток почек куриных эмбрионов. Вирус накапливается через 4 дня в титре 104,5 ТЦД 50/мл 1. Изучена возможность культивирования и титрования штамма 86 вируса инфекционной бурсальной болезни, обладающего минорным протеидом 86, на перевиваемых культурах клеток -. При этом ЦПД проявляется на 3-й день после заражения в виде грануляции - круглые и набухшие клетки располагаются в монослое поодиночке или в виде скоплений. Титр выделенного вируса на 4-й день после заражения составляет 106,0 ТЦД 50/мл. Иммуногенность составляет 632. Недостатками данных штаммов является то, что они не обладают достаточной иммуногенностью в условиях птицеводческих хозяйств Республики Беларусь, т.к. не совпадает минорный протеид. Задачей изобретения является получение штамма, обладающего стабильными свойствами и высокой иммуногенностью, который может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. Поставленная задача достигается тем, что штамм- КМИЭВ-13 - штамм-антиген был выделен из бурс (фабрициевых 10247 1 2008.02.28 сумок) больных инфекционной бурсальной болезнью кур в 2001 году на птицефабрике Дубовляны Минского района Минской области. Таксономическая принадлежность. Семейство , род . Культурально-морфологические признаки. Вирионы представляют собой сферические частицы, обладающие кубическим типом симметрии и состоящие из сердцевины и икосаэдрического капсида, построенного из 92 капсомеров, с диаметром без оболочки 55-65 нм. Состоит из 4 главных полипептидов. Вирус культивируется в куриных эмбрионах свободных от материнских антител. Молекулярно-биологические признаки. Вирион содержит 6 белков 1, с молекулярной массой 94 кД, является РНК-зависимой РНК-полимеразой и взаимодействует с геномными сегментами х с молекулярной массой 62 кД - предшественник 2 основной структурный белок с молекулярной массой 54 кД, ответственен за выработку вируснейтрализующих антител, является типоспецифическим антигеном структурный белок 3 с молекулярной массой 32 кД, является группоспецифическим антигеном 4 с молекулярной массой 28 кД - вирусная протеаза 13 - минорный полипротеид. Периодичность пассирования на системе один раз в 2 месяца на 9-10-дневных СПФ РЭК в разведении 10 по 0,2 мл на ХАО. Маркерные признаки. РНК вирус в градиенте сахарозы седиментирует одним пиком с константой 14, на 95 устойчива к действию РНК-азы. Онкогенкость. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ-13 не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ 13 свободен от бактериальной и грибковой флоры. Антигенная активность. При экспериментальном заражении серонегативной птицы вызывает образование вируснейтрализующих антител. Антигенность данного штамма в РН составляет 4 2 и выше, биологическая активность - 10-4,5 ЭИД 50/см 3. Иммуногенность составляет 80 и более. Безвредность. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ-13 апатогенен для цыплят. Титр для РЭК 106,2 ЭИД 50/мл. Условия хранения. Штамм инфекционной бурсальной болезни птиц КМИЭВ-13 хранится в замороженном состоянии при - 20 С в течение 2-х месяцев, в лиофилизированном состоянии при температуре не выше 4 С - 2 года. Устойчивость к физико-химическому воздействию. Вирус проявляет устойчивость при обработке 20 -м раствором хлороформа в течение 20 мин. При воздействии 1 -ого раствора фенола, формалина инактивация вируса наступает в течение 60 мин. В кислой среде вирус проявляет большую устойчивость, по сравнению с щелочной. Так, при экспозиции 30 мин и 7,3 вирус полностью сохраняет свою инфекционность,при 2,0 он остается жизнеспособным в течение 1 ч, а при 12,0 он быстро инактивируется. Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде при температуре 2-4 С или в морозильнике при - 20 С. Вирулентность. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ-13 не вирулентен. Иммуногенность. Иммуногенность штамма вируса инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ-13 составляет 80 . Чувствительность к антибиотикам. Устойчив к воздействию пенициллина и стрептомицина, но чувствителен к актиномицину. 10247 1 2008.02.28 1. Пример выделения штамма- КМИЭВ-13. ШтаммКМИЭВ-13 выделяли из бурс (фабрициевых сумок) больных инфекционной бурсальной болезнью кур путем заражения куриных эмбрионов в хориоаллантоисную полость. Культивирование вируса проводили на фибробластах куриных эмбрионов с коллагеназой, через 3-7 дней наблюдали образование симпластов и вакуолизацию пораженных клеток, а затем деструкцию монослоя. 2. Пример определения контроля контаминации штамма- КМИЭВ-13 вирусом инфекционного ларинготрахеита. Контроль отсутствия контаминации вирусом инфекционного ларинготрахеита проводили путем заражения штаммом инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ-13 5-ти эмбрионов кур 10-11-суточного возраста на хориоаллантоисную оболочку (ХАО) в области искусственной пуги в объеме 0,2 см 3. Время инкубации 168 ч в термостате при 37 С. Ежедневно проводили овоскопию эмбрионов. Погибшие эмбрионы с отметкой на них даты гибели помещали в холодильник и хранили при температуре 2-6 С до окончания опыта. Гибель эмбрионов в течение первых 24 ч после заражения считали не специфической и не учитывали. По истечении срока инкубации оставшиеся в живых эмбрионы помещали на 6-8 часов в холодильник при температуре 2-6 С. После этого все эмбрионы вскрывали и учитывали изменения гиперемия кожи и множественные очаги некроза ХАО. 3. Пример определения контроля контаминации штаммаКМИЭВ-13 вирусом инфекционного бронхита кур. Контроль отсутствия контаминации вирусом инфекционного бронхита кур проводили путем заражения штаммом инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ-13 5-ти эмбрионов кур 9-суточного возраста в аллантоисную полость в области естественной пуги в объеме 0,2 см 3. Время инкубации 192 ч в термостате при 37 С. Ежедневно проводили овоскопию эмбрионов. Дальнейшие исследования проводили, как и в примере 2. После этого все эмбрионы вскрывали и учитывали изменения отек головы, кровоизлияние на теле эмбриона, поражение печени и почек. 4. Пример определения иммуногенной активности. Иммуногенную активность оценивали путем экспериментального заражения двукратно с интервалом 10 дней 20 иммунизированных цыплят в возрасте 14 суток. 10 цыплят оставалось в качестве контроля. Иммуногенная активность составила 80 . Таким образом, штамм инфекционной бурсальной болезни КМИЭВ-13, обладая высокой иммуногенностью - 80(штамм вируса инфекционной бурсальной болезни 86,обладающего минорным протеидом 86 - прототип - 63 ) и стабильными биологическими свойствами (отсутствие контаминации), может быть использован для изготовления диагаостикумов и вакцин в качестве штамма-антигена. Источники информации 1.,,.,-2791842 // - 1999. - .73. -4. - . 2854-2863. 2. Сюрин В.Н., Самуиленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М. ВНИТИБП, 1998. - С. 68-77 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3