Штамм virus infectious laryngotracheitis avian КМИЭВ-21 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Гусев Анатолий Алексеевич Насонов Игорь Викторович Кныш Надежда Вячеславовна Костюк Наталья Ивановна Згировская Алла Александровна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(57) ШтаммКМИЭВ-21 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии, и касается штамма, выделенного от цыплят, больных инфекционным ларинготрахеитом, обладающего высокой иммуногенностью и биологической активностью, и может быть использовано в биологической промышленности для изготовления диагностикумов и вакцин. Известен штамм ЦНИИПП. Иммуногенность его составляет 85 , биологическая активность - 105,0 ЭИД 50/см 3 1. Известен штамм ВНИИБП. Иммуногенность его составляет 80 , биологическая активность - 105,0 ЭИД 50/см 3 1, 2. Недостатком данных штаммов является то, что они не обладают достаточной биологической активностью и иммуногенностью в условиях птицеводческих хозяйств Республики Беларусь. Кроме того, данные штаммы выделены в России от цыплят, больных инфекционным ларинготрахеитом. За прототип взят штаммКМИЭВ-20 - штаммантиген, выделенный в РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского в 1999 г. Иммуногенность его составляет 95 , биологическая активность 105,2 ЭИД 50/см 3 3. Данный штамм имеет по сравнению с другими аналогами высокую биологическую активность и иммуногенность. Однако при вакцинации новых кроссов цыплят, которые отличаются быстротой роста и развития, а также большей чувствительностью к воздействию внешних факторов, данный штамм иногда проявляет реактогенные свойства. 15932 1 2012.06.30 Задачей предлагаемого изобретения является селекция штамма, обладающего высокой иммуногенностью и биологической активностью,который может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. Поставленная задача достигается тем, что в качестве штамма-антигена был селекционирован штамм, обладающий высокой иммуногенностью и биологической активностью по отношению к эпизоотическим штаммам,циркулирующим в птицеводческих хозяйствах Республики Беларусь. Штаммдепонирован в коллекции микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского. Коллекционный номер - КМИЭВ-21. Характеристика штаммаКМИЭВ-21. Таксонометрическая принадлежность. Возбудителем инфекционного ларинготрахеита птиц является ДНК-содержащий вирус, сферической формы, относящийся к семейству герпесвирус, роду герпесвирус,.. Культурально-морфологические признаки. Вирусные частицы размером 87-97 нм имеют одну внешнюю оболочку толщиной 10 нм и значительно различаются по структуре нуклеоида. Количество различных форм вирусных частиц варьируется не только в ядрах, но и в разных участках одного и того же ядра. Вирус культивируется на ХАО развивающихся эмбрионов кур, уток, индеек и культурах клеток. Физико-химические свойства вируса. Вирус чувствителен к липолитическим агентам, теплу и различным дезинфентантам. Длительно сохраняется в лиофилизированном состоянии или при хранении при минус 20 минус 60 С (до 19 месяцев). При плюс 55 С разрушается в течение 10-15 минут, в 1 -ном растворе едкого натра и в 3 -ном растворе крезола инактивируется в течение 30 секунд. Химический состав не изучен. Антигенная структура. На основании общности антигена данный вирус принадлежит к роду герпесвирусов. Вирус индуцирует образование на ХАО мелко- и крупноочаговые поражения, легко нейтрализуется иммунными сыворотками. Антигенная активность. При экспериментальном заражении серонегативной птицы вызывает образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител. Вирус репродуцируется в РКЭ. Защитный титр вируснейтрализующих антител 1,8 . Иммуногенность. Иммуногенность штаммаКМИЭВ-21 - штаммаантигена составляет 95 . Патогенность. Непатогенен для цыплят в дозе в 10 раз превышающей иммунизирующую. Биологическая активность вируса. Определяется вирусологическим исследованием на РЭК 9-11-дневного возраста. Минимальная биологическая активность 106,0 ЭИД 50/см 3. Безвредность. Штамм вируса непатогенен для кур, индеек, фазанов. Кролики, морские свинки и белые крысы резистентны. Онкогенные свойства не изучены. Условия хранения. При пассированииКМИЭВ-21 - штамм-антиген путем заражения цыплят в течение 24 месяцев сохраняет биологическую активность и иммуногенность в течение 10 лет. 2 15932 1 2012.06.30 ВирусКМИЭВ-21 в лиофильном состоянии сохраняет биологическую активность в течение 10 лет. Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде с температурой 2-4 С. Пример 1. Выделение штаммаКМИЭВ-21. Штамм выделяли путем посева на ХАО эмбрионов кур и культуру клеток СПЭВ. На ХАО образовывались фокусные поражения 2 типов крупноузелковые с непрозрачной белой периферией и некротическим центром и мелкоузелковые - без некроза. Узелковые поражения проявлялись на всей поверхности ХАО, а очаговые только на месте инокуляции штамма вируса. В клетках СПЭВ формировались цитоплазматические включения и образовывались многоядерные клетки. Внутриклеточные включения обнаруживались через 12 часов и наивысшей концентрации достигали через 30-36 часов после заражения. В инфицированных культурах клеток штаммКМИЭВ-21 вызывал образование бляшек. Пример 2. Определение биологической активности штаммаКМИЭВ-21. Биологическую активность штаммаКМИЭВ-21 штамма-антигена определяли титрованием каждой серии вируссодержащего материала на 9-дневных эмбрионах кур. Титрование проводили следующим образом брали 9 ампул вируссодержащего материала, из которых составляли 3 пробы (по 3 ампулы в каждой пробе) и параллельно их титровали. Содержимое трех ампул растворяли в 6 см 3 стерильного физиологического раствора, содержащем 2 мг гентамицина в см 3. В ряд стерильных пробирок,количество которых равняется количеству разведений и соответственно обозначенных, вливали физиологический раствор или раствор Хенкса по 9 см 3. Из исходного разведения(110) переносили 1 см 3 в следующую пробирку, причем пипетка не должна касаться жидкости. Использованную пипетку погружали в дезинфицирующий раствор. Другой, чистой пипеткой смешивали жидкость и переносили вирус в объеме 1 см 3 в следующую пробирку и.т.д. Вирусом каждого разведения заражали по 4 эмбриона 9-дневного возраста на ХАО по 0,2 см 3. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили в течение 5 суток. Вскрывали все эмбрионы (погибшие и живые) и отмечали у них наличие на хориоаллантоисной оболочке изменения, свойственные вирусу ИЛТ. На основании учета поражений хориоаллантоисной оболочки живых и погибших эмбрионов вычисляли эмбриональную инфекционную дозу вируса и количество таких доз в 1 см 3 сухого вируссодержащего препарата. Вначале вычисляли процент инфекционности, руководствуясь следующим примером титрования вирулентного вируса инфекционного ларинготрахеита на эмбрионах кур. Результаты определения вируса в зараженных эмбрионах (по наличию изменений, характерных для вируса ИЛТ на хориоаллантоисной оболочке) отмечены в таблице. Результаты определения вируса в зараженных эмбрионах Разведение вируса Исходный материал 0 0 0 0 0 Примечание- эмбрион, погибший или выживший, у которого хориоаллантоисная оболочка поражена вирусом ИЛТ 0 - эмбрион, у которого отсутствует поражение хориоаллантоисной оболочки. 3 15932 1 2012.06.30 Поражение хориоаллантоисной оболочки установлено у всех эмбрионов в разведениях 10 , 10-2, 10-3, в разведениях 10-4 и 10-5 у трех эмбрионов, а в 10-6 и 10-7 у двух эмбрионов. Таким образом, минимальная биологическая активность 106,0 ЭИД 50/см 3. Пример 3. Изучение иммуногенностиКМИЭВ-21. ИммуногенностьКМИЭВ-21 - штамма-антигена изучали путем контрольного заражения 20 ранее вакцинированных данным штаммом и 20 контрольных невакцинированных цыплят 35-дневного возраста. Контрольное заражение проводили через 15 дней после иммунизации путем введения в трахею ранее оттитрованного на цыплятах вирулентного штамма Богатищевский. Наблюдение за зараженной птицей вели в течение 10 дней. В опытной группе у одного цыпленка проявились клинические признаки заболевания, в контрольной заболели все 20 цыплят. Иммуногенность составила 95 . Таким образом, данный штаммКМИЭВ-21 штамм-антиген, обладая высокой биологической активностью 106,0 ЭИД 50/см 3 и высокой иммуногенной активностью (95 ) может быть использован в биологической промышленности для изготовления диагностикумов и вакцин. Источники информации 1. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М. ВНИТИБП, 1998. - С. 680-682. 2. Чурин А.И. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц получение и использование. - Покров, 2007. - С. 7-9. 3. Заявка РБ а 20051332, 2007 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4