Штамм Porcine reproductive and respiratory syndrome virus рода Arterivirus КМИЭВ-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММРОДАКМИЭВ-35 ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНОРЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Ястребов Аскалон Сергеевич Савельева Тамара Александровна Пунтус Ирина Анатолиевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(57) ШтаммродаКМИЭВ-35 для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС). Штамм вируса РРСС может быть использован для изготовления вакцины против РРСС. Известен штамм вируса РРСС, выделенный от больных свиней в Голландии, названный агентом Лелистад. Он относится к РНК-содержащим вирусам, размером 45-65 нм,имеет наружную оболочку и чувствителен к липидным растворителям. По своим физикохимическим свойствам относится к семейству , роду 1. Недостатком штамма Лелистад является непригодность в использовании для получения эффективных вакцин на территории Республики Беларусь из-за отличий в антигенной структуре. Известен американский штамм вируса РРСС -. Геном штамма состоит из плюсцепи РНК, диаметром 45-65 нм, который заключен в капсид. Нуклеокапсид имеет диаметр 35 нм, заключен в липидный слой. Штамм вируса РРСС - чувствителен к липидным растворителям и полностью инактивируется хлороформом и эфиром 2. Недостатком штамма является его принадлежность к американской подгруппе штаммов вируса РРСС, а следовательно, его непригодность в использовании для получения эффективных вакцин на территории Республики Беларусь. 10947 1 2008.08.30 Известен штамм вируса РРСС -99/, выделенного в России, относящийся к РНК-содержащим вирусам, размером 45-65 нм, имеет наружную оболочку и чувствителен к липидным растворителям 3. Недостатком является то, что выделенный в России штамм вируса РРСС -99/ по своим биологическим свойствам принадлежит к европейскому штамму вируса РРСС Лелистад, однако отличается от него по нуклеотидному составу на 12 . Задачей изобретения является изоляция штамма вируса РРСС, выделенного в хозяйствах непосредственно на территории Республики Беларусь, который может быть использован для изготовления вакцины против РРСС. Поставленная задача достигается тем, что штаммрода(коллекция музея микроорганизмов РУН Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского), коллекционный номер КМИЭВ-35,используемый для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, позволяет создать вакцину, обеспечивающую эффективную защиту у свиней от репродуктивно-респираторного синдрома на территории Республики Беларусь, так как он выделен непосредственно на территории республики. Предлагаемый штамм вируса РРСС характеризуется Таксономическая принадлежность. Штамм вируса РРСС КМИЭВ-35 относится к семейству , роду , виду. Морфологические признаки штамма вируса РРСС КМИЭВ-35. Вирионы диаметром 45-70 нм, их плавучая плотность в сахарозе составляет 1,13-1,17 г/см 3, хлористом цезии 1,17-1,20 г/см 3. Штамм вируса РРСС репродуцируется в цитоплазме клетки, чувствителен к хлороформу и эфиру, колебаниямниже 5,0 и выше 7,0, Снижает свою активность при 37 С через 3 ч, при 20 С через 20 ч, при 56 С через 6 мин. Инактивируется при 56 С в течение 45 мин. Биологические свойства. Штамм вируса РРСС не обладает гемагглютинирующими свойствами по отношению к эритроцитам крупного рогатого скота, кролика, кур, лошади,морской свинки, свиньи, крысы и человека. Обладает антигенными свойствами, не чувствителен к антибиотикам. Культивирование. Штамм вируса РРСС репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах свиней. Чувствительными к вирусу являются 2 клоновых варианта перевиваемой линии клеток МА-1042621 и -145. Вирулентность. Штамм вируса РРСС КМИЭВ-35 патогенен для свиней и непатогенен для лабораторных животных (кролика, морской свинки, белой мыши). Пример 1. Выделение штамма вируса РРСС. Проводили до 2-3 слепых последовательных пассажей патматериала на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней, так как в первых двух пассажах патматериала ЦПД может отсутствовать. Полученную культуральную жидкость после двукратного замораживания и оттаивания по 0,2-0,4 мл вносили в пробирки с перевиваемой культурой клеток -145. Для работы использовали культуру клеток -145 на 2-й день роста клеток, когда монослой клеток не был полностью сформирован (логарифмическая фаза роста клеток). Инкубирование культуральной жидкости проводили в термостате при 37 С в течение 60 мин. Культуральную жидкость сливали, монослой клеток промывали средой Игла и вносили в каждую пробирку по 1,0 мл свежей поддерживающей среды Игла с добавлением к ней 10-20 мкг/мл трипсина, 2-4 фетальной сыворотки крупного рогатого скота, гентамицина из расчета 50 мкг/мл, амфотерицина 2,5 мг/мл и глютамина 0,3 мг/мл. Инкубирование клеток проводили в термостате при 37 С в течение 3-7 дней,ежедневно проводили микроскопию монослоя клеток с целью обнаружения цитопатиче 2 10947 1 2008.08.30 ского действия штамма вируса РРСС. Проводили 3-5 последовательных пассажей патологического материала до появления ЦПД вируса. Пример 2. Титрирование штамма вируса РРСС. Штамм вируса РРСС титровали на культуре клеток -145. Делали десятикратные разведения вируса, начиная от 10-1 до 10-7, на каждое разведение вируса использовали 4 пробирки с культурой клеток. Штамм вируса РРСС вносили по 0,1 мл на пробирку,предварительно сливали ростовую среду и монослой промывали средой Игла. Штамм вируса РРСС на культуре клеток инкубировали в термостате при 37 С в течение 5-7 дней,ежедневно микроскопировали культуру клеток. Цитопатическое действие вируса проявлялось с 3-5 дня и длилось до 7 суток. Учитывали результаты микроскопии, титр вируса высчитывали по методу Рида и Менча. Результаты титрования штамма вируса РРСС КМИЭВ-35 приведены в табл. 1. Таблица 1 Инфекционный титр штамма вируса РРСС на культуре клеток -145 КолУчет результатов ЦПД штамма вируса РРСС в пробирках Разведение во с культурой клеток по дням штамма вирупроса РРСС 18.06.2002 19.06.2002 20.06.2002 23.06.2002 24.06.2002 25.06.2002 бирок 10-1 4 4/0 4/0 4/4 4/4 4/4 4/4 Примечание 1) заражение культуры клеток штаммом вируса РРСС произведено 18.06.02, окончательный учет результатов титрования - 25.06.02 2) в числителе - количество пробирок с культурой клеток, взятых в опыт, в знаменателе - количество пробирок с клетками, в которых отмечено ЦПД штамма вируса РРСС. Титр штамма вируса РРСС высчитывали по методу Рида и Менча. Он составил 4,76 ТЦД 50/0,1 мл. Пример 3. Идентификация штамма вируса РРСС. Идентификацию выделенного изолята штамма вируса РРСС проводили в перекрестной реакции нейтрализации на культуре клеток -145 с использованием иммунной сыворотки крови свиней или кроликов к эталонному штамму вируса РРСС, нормальной сыворотки крови здорового поросенка, свободной (контроль) от антител к вирусу РРСС, и сыворотки крови к парвовирусу свиней (контроль). Реакцию нейтрализации ставили по общепринятой методике с постоянной дозой вируса (100 ТЦД 50/0,1 мл) и разведением сывороток 15-110. Результаты опыта учитывали в течение 7 дней и приведены в табл. 2. 10947 1 2008.08.30 Таблица 2 Идентификация изолированного штамма вируса РРСС в реакции нейтрализации на культуре клеток -145 Эталонный штамм вируса РРСС Эталонный штамм вируса РРССиммунная сыворотка к вирусу РРСС Эталонный штамм вируса РРССнормальная сыворотка свиней (контроль) Эталонный штамм вируса РРССсыворотка к парвовирусу свиней Изолят вируса РРСС Изолят вируса РРССиммунная сыворотка к вирусу РРСС Изолят вируса РРССнормальная сыворотка свиней (контроль) Изолят вируса РРССсыворотка к парвовирусу свиней (контроль) Незараженная культура клеток Примечания 1) эталонный штамм вируса РРСС и изолят вируса РРСС КМИЭВ-35 разводили средой Игла 1100 (10-2) 2) иммунную сыворотку к штамму вируса РРСС, парвовирусу и нормальную сыворотку здорового поросенка разводили средой Игла 15 3) заражение культуры клеток -145 вирусами РРСС проводили 10.05.02, окончательные результаты опыта учитывали 17.05.02 4) в числителе - количество пробирок с культурой клеток в опыте, в знаменателе количество пробирок с культурой клеток, в которых отмечено ЦПД вируса. Из табл. 2 видно, что штаммродаКМИЭВ-35, как и эталонный штамм вируса РРСС , нейтрализуется антителами иммунной сыворотки к эталонному штамму вируса РРСС и проявляет цитопатогенное действие на культуре клеток -145 в присутствии нормальной сыворотки здорового поросенка и сыворотки к парвовирусу свиней. Полученные результаты указывают на то, что изолят вируса РРСС КМИЭВ-35 является штаммом вируса РРСС. Пример 4. Вирулентность штамма вируса РРСС для лабораторных животных и свиней. Испытывали вирулентность изолята штамма вируса РРСС на лабораторных животных(кроликах, морских свинках, белых мышах) и поросятах. Для этой цели в опыте использовали 5 кроликов живой массой 2,0-2,4 кг, 5 морских свинок, 10 белых мышей живой массой 16-18 г, 2 клинически здоровых поросенка в возрасте 5 недель. Штамм вируса РРСС выращивали на культуре клеток -145 в 1,5-литровом матрасе. После проявления цитопатогенного действия вируса на клетках на 4-6-й дни после заражения матрас дважды 4 10947 1 2008.08.30 замораживали и оттаивали. Для заражения животных использовали культуральную вируссодержащую жидкость, которую вводили внутримышечно кроликам - 5,0 мл, морским свинкам - 3,0 мл подкожно белым мышам по 0,5 мл, интранозально поросятам - 1,0 мл. За зараженными животными вели клиническое наблюдение в течение 10 дней. Лабораторные животные после введения им штаммародаКМИЭВ-35 оставались в течение 10 дней здоровыми. У 2-х поросят, которым введен вирус РРСС, на 4-5-й день отмечали угнетение, отказ от корма, затрудненное дыхание, конъюнктивиты, посинение кожи ушей и подгрудка. Температура тела на 4-5-й день после заражения была повышена на 0,2-0,8 С, после чего приходила постепенно к норме. В дальнейшем животные выздоравливали. Лабораторные животные (кролики, морские свинки, белые мыши) оставались клинически здоровыми в течение срока наблюдения. Таким образом, штаммродаКМИЭВ-35 патогенен для свиней и непатогенен для лабораторных животных(кроликов, морских свинок, белых мышей). Может быть использован для конструирования вакцины против РРСС после изучения его антигенной активности и иммунных свойств. Таким образом, выделенный штамм вируса РРСС изолирован в хозяйствах непосредственно на территории Республики Беларусь и может быть использован для изготовления эффективной вакцины против РРСС, а способ его выделения более упрощен и ускорен, изза отсутствия операции предварительного пассирования на поросятах. Источники информации 1..,С.,.// . . - 1991. - . 13. - . 121-130. 2. Балашова Е.А., Куринов В.В., Вишняков И.Ф. и др. Чувствительность некоторых перевиваемых культур клеток к вирусу РРСС. Вирусные болезни сельскохозяйственных животных Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 96. 3. Дудникова Н.С., Пыльнов В.А., Гусева Е.В., Дудников С.А., Канышина А.В. Выделение вируса РРСС и его адаптация к перевиваемой линии клеток -145 // Ветеринария. - 2002. -6 (прототип штамма). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5