Способ выявления бактерий рода HELICOBACTER в тощаковой порции желудочного содержимого

01 33/48, 12 1/20 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДАВ ТОЩАКОВОЙ ПОРЦИИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОДЕРЖИМОГО(71) Заявитель Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Конорев Марат Русланович Литвяков Александр Михайлович Матвеенко Майя Ефимовна Крылов Юрий Васильевич Жаворонок Сергей Владимирович Ковалев Александр Владимирович Рящиков Анатолий Аркадьевич Щупакова Алина Николаевна(73) Патентообладатель Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ диагностики бактерийв тощаковой порции желудочного содержимого, включающий получение тощаковой порции желудочного содержимого, его разделение, приготовление диагностического препарата, высушивание, окрашивание, бактериоскопию и подсчет бактерий, отличающийся тем, что разделение тощаковой порции желудочного содержимого на компонентыосадок, надосадок и взвесьпроводят под действием силы тяжести, диагностические препараты готовят из каждого компонента, окрашивание препаратов ведут по методу Вартина-Старри, при этом бактериоскопию и подсчет бактерий проводят в препарате каждого компонента.(56) ДОРОФЕЙЧУК В.Г. и др. Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. -8. С. 42-44.2092855 1, 1997.2084533 1, 1997.5498528 , 1996. Изобретение относится к медицине, в частности к внутренним болезням и патологической анатомии, а также к микробиологии и может быть использовано для микроскопической диагностикив тощаковой порции желудочного содержимого с последующим назначением этиопатогенетического лечения при хроническом гастрите типа В 6 и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки 2, 3. В настоящее время применяются различные методы выявления. Все они делятся на две большие группы прямые (с использованием биопсийного материала) и непрямые (без использования последнего) 11. 5031 1 1. Морфологические методы выявленияв биопсийном материале 10 с использованием различных окрасок. Все они достаточно специфичны. Наиболее чувствительными являются окраски акридиновым оранжевым (85 ) и красителем Гимзы (79 ), несколько менее чувствительными - окраски по Граму (72 ) и серебрением по Вартин-Старри (67 ). Обнаружитьможно и на обычных, окрашенных гематоксилином и эозином, препаратах. Основной недостаток метода - инвазивность. 2. Биохимический метод диагностики . Последний основан на обнаружении уреазы,которую продуцируют бактерии, в слизистой оболочке желудка. При разложении мочевины уреазой образуется ион аммония. Это приводит к сильному увеличению рН среды, что фиксируется с помощью индикатора. По изменению окраски реактива определяется уреазная активность биоптата 8. Специфичность данного метода составляет 100 , чувствительность - 99 . Данный метод, как и предыдущий, относится к инвазивным. Это в какой-то мере ограничивает его практическое применение. 3. Микробиологическая диагностика . Предметом исследования для микробиологической диагностикиявляется биоптат слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки с последующей обработкой и посевом на дифференциально-диагностические среды. Данный метод дорогой, обладает невысокой специфичностью (53 ) и чувствительностью (77 ) 12. В связи с этим его относят к дополнительным методам диагностики НР-инфекции. 4. Радионуклидные методы диагностикив своей сущности основаны на прямом или косвенном определении уреазной активности 1. В этих методах используется мочевина, меченная изотопами углерода 14 С или 13 С и их концентрация определяется в выдыхаемом человеком 2. При правильном проведении исследования их чувствительность составляет 95 , а специфичность - 98 . Методы, кроме явных преимуществ, имеют и существенные недостатки. В частности метод с определением 14 С не может использоваться у детей и беременных женщин ввиду его радиоактивности. Метод с определением 13 С может применяться у всех, он абсолютно безопасен, но использование массспектрометра чрезвычайно дорого (до 250000 долларов США). 5. Иммунологические методы диагностикиосновываются на том факте, что у всех больных, инфицированных , в слизистой оболочке желудка продуцируются антитела к антигенам, покрывающим клеточную стенку и жгутики бактерий. В подавляющем большинстве случаев эти антитела можно обнаружить в сыворотке крови различными методами 1. Наиболее интенсивно используется в последнее время метод иммуноферментного анализа (ИФА). Сегодня он является наиболее предпочтительным из методов иммунологической диагностики. Специфичность этого метода составляет 95-100 , чувствительность - 100 . Он является инвазивным и довольно сложным в исполнении. Кроме этого,около 5 сывороток дают ложноположительный результат. Задачей изобретения является разработка бактериоскопического способа выявленияв любых компонентах тощаковой порции желудочного содержимого, с разделением последнего под действием силы тяжести, что сохраняет структуру и антигенный состав микроорганизмов. В качестве прототипа предлагаемого изобретения принят существующий неинвазивный способ обнаруженияпутем бактериоскопии осадка тощаковой порции желудочного сока, полученного центрифугированием при 3-4 тысяч об/мин в течение 30-40 мин, с последующей бактериоскопией мазка осадка, окрашенного по методу РомановскогоГимзы 4. Прототип по сравнению с вышеизложенными методами обладает рядом преимуществ 1. Достаточная информативность. 2. Исключение инвазивности. 3. Определениев короткий срок (1,5 ч). 4. Простота исполнения. 2 5031 1 Наряду с преимуществами прототип обладает и рядом существенных недостатков. 1. Осаждение при 3-4 тысяч об/мин в течение 30-40 мин приводит к разрушению целых бактерий с образованием большого количества фрагментов (остатки клеточной стенки и ядерного аппарата ). Это затрудняет подсчет микроорганизмов в желудочном содержимом и, следовательно, снижает информативность метода. 2. Центрифугирование приводит к структурным повреждениям клеточной стенки бактерий с изменением ее антигенного состава. Это создает трудности при проведении иммунологических методов диагностики , основанных на выявлении антител к поверхностным антигенам микроорганизма. 3. При осаждении предложенным способом, в связи с ограничением скорости вращения из-за повышенного разрушения микроорганизмов, часть бактерий остается в надосадке. Следовательно, снижается диагностическая возможность метода. Это подтверждают и сами авторы 4 совпадение результатов бактериоскопического исследования осадка желудочного сока наи уреазного теста с тем же осадком установлены в 837 случаев. 4. При окраске по методу Романовского-Гимзы в осадке желудочного сока определяются не все формы бактерий в связи с интенсивно окрашенным фоном, что снижает чувствительность метода. Сущность предложения заключается в том, что разделение тощаковой порции желудочного содержимого на компоненты - осадок, надосадок и взвесь - проводят под действием силы тяжести, диагностические препараты готовят из каждого компонента,окрашивание препаратов ведут по методу Вартина-Старри, при этом бактериоскопию и подсчет бактерий проводят в препарате каждого компонента. Примеры осуществления способа. А. Общие положения. Родопределяли согласно краткому определителю бактерий Берги 5. В биопсийном материалеобычно имеют вид тонких, спирально изогнутых, неспорообразующих палочек (ширина 0,5-0,6 мкм, длина 2-6 мкм) или приобретают округлую форму(при поперечном срезе бактерии). В мазках, приготовленных из компонентов желудочного содержимого, они образуют -образную или -образную (при соединении двух клеток в короткую цепочку) формы, а также могут выявляться в виде кокков. Переходв кокковидную форму обусловлен неблагоприятными условиями среды обитания лишение необходимых органических субстратов, увеличение рН среды. Степень обсемененностиопределяют по количеству микробов в поле зрения микроскопа при увеличении 900 9 отсутствие интенсивно окрашенных форм бактерий -, только немногочисленные бактерии фокально, умеренное количество бактерий в нескольких областях, изобилие бактерий в большинстве областей. Выявлениепроизводили морфологическим методом, используя гистологические срезы, параллельно окрашенные гематоксилином и эозином, по методам РомановскогоГимзы и Вартина-Старри, а также неинвазивным методом 4, используя мазок осадка тощаковой порции желудочного сока, окрашенного по методу Романовского-Гимзы. Нами обследовано 43 человека с заболеваниями гастродуоденальной зоны. При гистологическом исследовании биоптатов обнаружены хронический неатрофический гастрит антрального отдела желудка (37 ), атрофический гастрит (63 ), эрозии в желудке(47 ), хроническая язва желудка (20 ) и двенадцатиперстной (14 ). .обнаружен у 83 больных язвенной болезнью в фазе обострения, у 78- в фазе ремиссии и у 58 больных хроническим гастритом. Степень обсемененностибыла выше у больных с активным процессом в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны. Оценку эффективности нашего метода диагностики и прототипа проводили у одних и тех же больных по методу. 7. В качестве метода сравнения использовали морфологический способ выявленияв биопсийном материале 10 с ис 3 5031 1 пользованием гистологических срезов, параллельно окрашенных гематоксилином и эозином, по методам Романовского-Гимзы и Вартина-Старри. Б. Условия осуществления способа. Способ осуществляется следующим образом Порцию желудочного содержимого, полученную натощак, инкубируют при комнатной температуре 15-20 мин, до разделения желудочного содержимого на компоненты(осадок, надосадок, слизь, взвесь слущенных клеток покровного эпителия). Из компонентов желудочного содержимого, с помощью пастеровской пипетки, готовят препараты путем распределения 0,04-0,06 мл (2-3 капли) на площади 2550 мм (500 мм 2), высушивают и окрашивают по методу Вартина-Старри. Бактериоскопию и подсчетпроизводят в мазке каждого компонента. Модификация способа отличается тем, что окраску мазков производят по методу Гримелиуса или Романовского-Гимзы 1. Эффективность метода. Оценка эффективности предложенного метода и прототипа представлена в таблице. Оценка эффективности методов диагностикив тощаковой порции желудочного содержимого 1. Точность 71 2. Диагностическая эффективность 71 3. Специфичность 50 4. Чувствительность 85 5. Предсказующая ценность пробы при отрица 67 тельном результате 6. Предсказующая ценность пробы при положи 100 73 тельном результате Эффективность способа заключается в том, что он позволяет повысить точность, специфичность, чувствительность и предсказующую ценность определения .в тощаковой порции желудочного содержимого и дает возможность определять любые формы микроорганизмов с сохранением структуры и антигенного состава бактерий. Клинические примеры. Больной А., 18 лет находился в гастроэнтерологическом отделении Витебской областной клинической больницы с 24.03.97 по 05.04.97 с диагнозом Хронический поверхностный гастрит, обострение, средней тяжести. Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки,неактивная фаза. Рубцово-язвенная деформация пилоробульбарной зоны. Хронический поверхностный дуоденит. Эрозии луковицы двенадцатиперстной кишки. Поступил с жалобами на боли в эпигастрии, появляющиеся через 1-2 часа после еды,голодные, ночные боли, резкую слабость. Болевой синдром беспокоит около двух недель. В анамнезе страдает язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки около 1,5 лет. Отмечает нерегулярное питание, обильную еду на ночь. При пальпации определяется болезненность в эпигастрии, пилородуоденальной области. При проведении ФЭГДС 25.03.97 обнаружены выраженный поверхностный гастрит, постязвенный рубец луковицы двенадцатиперстной кишки, рубцовая деформация пилоробульбарной зоны, эрозии луковицы двенадцатиперстной кишки. При морфологическом исследовании желудка и двенадцатиперстной кишки обнаружен хронический неатрофический гастрит антрального отдела желудка со слабым воспалением , активностью , обсемененностью. Хронический неатрофический дуоденит, с умеренным воспалением , активностью , отсутст 4 5031 1 вием(-). Бактериоскопическое исследование надосадка, осадка и взвеси тощаковой порции желудочного содержимого описанным способом позволило установить слабое обсеменение , только немногочисленные бактерии фокально , во всех трех компонентах желудочного сока, причем определялись как кокковидные, так и вегетирующие формы микроорганизмов в соотношении 11. Больная ., 40 лет находилась на диспансерном наблюдении в клинике научноисследовательского клинического института радиационной медицины и эндокринологии(г. Витебск) с диагнозом хронический очаговый атрофический гастрит, с сохраненной секреторной функцией желудка, обострение, средней тяжести. Полип антрального отдела желудка. Обратилась 10.03.97 с жалобами на чувство тяжести и распирания в эпигастрии после еды, отрыжку пищей. При пальпации определяется умеренная болезненность в эпигастрии. При проведении ФЭГДС 10.03.97 обнаружены хронический очаговый атрофический гастрит, полип антрального отдела желудка 1,0 см в диаметре. При морфологическом исследовании желудка диагностирован хронический антральный гастрит с умеренной атрофией желез, с минимальным воспалением , активностью , отсутствием(-),гиперпластический полип антрального отдела желудка. Бактериоскопическое исследование надосадка, осадка и взвеси тощаковой порции желудочного содержимого описанным способом не выявило(-) во всех трех компонентах желудочного сока. Источники информации 1. Аруин Л.И., Григорьев П. Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам, 1993. - С. 306-308. 2. Голиков С.Н., Рысс Е.С., Фишзон-Рысс Ю.И. Рациональная фармакотерапия гастроэнтерологических заболеваний. - СПб. Гиппократ, 1993. - С. 288. 3. Григорьев П.Я. Диагностика и лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. - М Медицина, 1986. - С. 224. 4. Дорофейчук В.Г., Потехин П.П., Закомерный А.Г. Неинвазивный способ диагностики пилорического хеликобактериоза // Клин. лаб. диагностика. - 1997. -8. - С. 42-44. 5. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоулта пер. с англ. - М., Медицина, 1980. 6. Мараховский Ю.Х. Общая гастроэнтерология. Основная терминология и диагностические критерии. - Мн., 1995. 7.,,,.// - 1981. - . 94, 42. - . 553-600. 8.,,.-// . . . - 1987. - . 82. - . 200-201. 9.// . . . - 1991. . 6. - . 209-222. 10.,,// . . . . . - 1990. - . 9, -. 5. 11..,-// - 1988. - . 39. - . 763-766. 12..,.,..// . -1997. - . 40, 1. - 726. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5