Бактериальное удобрение для рыбоводного пруда

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БАКТЕРИАЛЬНОЕ УДОБРЕНИЕ ДЛЯ РЫБОВОДНОГО ПРУДА(71) Заявитель Республиканское дочернее унитарное предприятие Институт рыбного хозяйства Республиканского унитарного предприятия Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству(72) Авторы Скурат Эвелина Казимировна Сиволоцкая Валентина Алексеевна Говор Татьяна Альфонсовна Асадчая Раиса Леонидовна(73) Патентообладатель Республиканское дочернее унитарное предприятие Институт рыбного хозяйства Республиканского унитарного предприятия Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству(57) Бактериальное удобрение для рыбоводного пруда, содержащее клетки азотобактер,отличающееся тем, что содержит в качестве азотобактера штаммКМИЭВ 7-16 Д и, дополнительно, штаммКМИЭВ 6-28 Д и комбикорм для прудовых карповых рыб в качестве адсорбента, причем 1 г удобрения влажностью 7-9 содержит 5 млн. живых клеток указанных штаммов, взятых в соотношении,соответственно, 14. Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства бактериальных удобрений, которые могут найти применение в рыбоводстве во внутренних водоемах для повышения рыбопродуктивности и профилактики болезней рыб (аэромоноз, воспаление плавательного пузыря - секундарная инфекция и др.). Известно применение минеральных удобрений (например, азотные удобрения - мочевина, нитратные) в рыбоводстве, которые способствуют повышению первичной продукции фитопланктона и выделению фитопланктоном в пруду кислорода 1. Но применение минеральных удобрений имеет недостаток, заключающийся в том, что эти удобрения усваиваются, в первую очередь, высшей водной растительностью, что приводит к зарастанию прудов. Кроме того, азот минеральных удобрений связывается с донными соединениями и значительное количество биогена переходит в органическое состояние, недоступное для гидробионтов. Известно применение органических удобрений, например навоза, в рыбоводных прудах с целью обеспечения дополнительного прироста рыбопродукции 2. 10942 1 2008.08.30 Но навоз нарушает экологическое равновесие прудовой системы в вегетационный период, так как это приводит к снижению содержания кислорода в воде, что может вызвать заморные явления. Известно также бактериальное удобрение, состоящее из культур бактерий азотобактерин, выделенных из почвы. Причем азотобактерин вносился в пруд на адсорбенте торфе 3. Однако культуры бактерий азотобактерин, выделенные из почвы, в прудах приживаются очень плохо, т.к. в условиях водоема могут быть пригодны только специальные препараты, приготовленные на основе штаммов, выделенных не из почвы, а из водной среды. Кроме того, это удобрение не пригодно для профилактики болезней рыб. Задачей настоящего изобретения является создание бактериального удобрения, повышающего рыбопродуктивность прудов и одновременно способного профилактировать отдельные инфекционные болезни рыб (например аэромоноз, воспаление плавательного пузыря - секундарная инфекция и др.). Поставленная задача достигается тем, что бактериальное удобрение для рыбоводного пруда, содержащее клетки азотобактер, содержит в качестве азотобактера штаммКМИЭВ 7-16 Д и, дополнительно, штаммКМИЭВ 6-28 Д и комбикорм для прудовых карповых рыб в качестве адсорбента, причем 1 г удобрения влажностью 7-9 содержит 5 млн. живых клеток указанных штаммов, взятых в соотношении, соответственно, 14. ШтаммКМИЭВ 7-16 Д имеет следующую характеристику. Морфология. Овальные клетки 2 мкм и более в поперечнике, длина варьируется вплоть до кокковидной формы. Встречаются поодиночке, парами и неправильными группами лишь редко образуют цепочки более чем из 4 клеток. Отмечается выраженный полиморфизм. Эндоспор не бывает, но образуются толстостенные цисты. Могут вырабатывать большое количество капсульной слизи. Движутся с помощью перитрихиальных жгутиков или неподвижны. Обычно грамотрицательные, но реакция по Грамму варьирует. Физиология. Как правило, несимбиотически фиксируют по меньшей мере 10 мг атмосферного азота на 1 г потребленного углевода. Среда для роста содержит углеводы (обычно глюкозу), спирты или органические кислоты. Не протеолитические, но могут использовать нитрат, аммиак и аминокислоты как источники азота. Каталазоположительные. Хорошо растут в аэробных условиях, но могут расти и при пониженном парциальном давлении кислорода. Оптимальная температура между 20 и 30 С. Пределы рН для роста 5,5-8,5, оптимум 7,0-7,5. Содержание ГЦ в ДНК от 63 до 66 мол.4. ШтаммКМИЭВ 6-28 Д - антагонист бактерий-возбудителей аэромоноза рыб. Обладает устойчивым ингибирующим действием по отношению к возбудителям аэромоноза, не патогенен и не токсичен для рыб и лабораторных животных. ШтаммКМИЭВ 6-28 Д имеет следующую характеристику. Морфология. Клетки размерами 2,5-5,01,5-3,0 мкм., овальные или мелкие, кокковидные. Расположены одиночно, парами или группами. Полиморфны. Колонии не пигментированы. Эндоспор и цист не образуют, подвижны, выделяют капсульную слизь. Грамвариабельны. Физиология. Растет на среде Эшби при 20-30 С и при рН 5-9. Аэроб. Желатину не разжижает, вызывает помутнение МПБ. Редуцирует метиленовую синь и нитраты. Отношение к углеводам. Разлагает сахарозу, лактозу, глюкозу, мальтозу с образованием кислоты и газа. 2 10942 1 2008.08.30 Отношение к спиртам. Разлагает манит. Дульцит не разлагает. Не обладает аминолитической активностью, не гемолизует эритроциты барана. Каталазоположителен. На стерильном обезжиренном молоке и в молочной сыворотке образует молочную кислоту и витамины группы В. Не патогенен и не токсичен для теплокровных лабораторных животных (контрольные исследования БелНИЭВ). Токсикогенность. Смывы суточных агаровых культур в концентрации 1,5 млрд.,1,0 млрд., 50 млн. микробных тел, инактивированные нагреванием, не вызывали гибели белых мышей при внутрибрюшинном введении. Вирулентность. Введение смывов 18-часовой агаровой культуры в разведении 1,5 млрд.,1,0 млрд., 50 млн. белым мышам не сопровождалось гибелью. Обладает устойчивым ингибирующим действием к бактериям рода- возбудителям аэромоноза рыб. Отношение к антибиотикам. Устойчив к рифампицину и левомицетину, чувствителен к ампицилину, стрептомицину, эритромицину. Хранится на среде Эшби в холодильнике при 4-6 С и в лиофилизированной культуре при 4 С 5. В заявленном изобретении в качестве адсорбента используют комбикорм для прудовых карповых рыб. В принципе, можно использовать любой адсорбент (сухое молоко,кукурузную муку), но наиболее оптимальным адсорбентом, обладающим наибольшей адсорбционной способностью, является комбикорм для прудовых карповых рыб, отвечающий определенным требованиям выпускается в виде гранул, что увеличивает адсорбционную поверхность срок хранения жизнеспособности бактерий на данном адсорбенте максимальный (1 год против 1-3 месяцев на вышеприведенных адсорбентах, благодаря его физико-химическим показателям (влажность, физико-химические свойства, позволяющие подвергать его необходимой для создания удобрения стерилизации при 120 С. Всем этим требованиям отвечает комбикорм для прудовых карповых рыб 6. Для выполнения поставленной задачи нами изучалась возможность симбиотического развития отобранных штаммов. Целью являлось получение симбиоза двух штаммов бактерий, активно фиксирующих азот водной среды, подавляя при этом численность аэромонад - возбудителей инфекционных заболеваний рыб. Следует отметить, что бактерии .относятся к группе условно-патогенных. Они широко представлены в водной среде практически всех водоемов, являются постоянными обитателями организма водных животных, при понижении резистентности которых аэромонады приобретают вирулентные свойства, что приводит к развитию патологического процесса. Для получения симбиоза испытывались различные комбинации соотношенийКМИ-ЭВ 7-16 Д иКМИЭВ 6-28 Д. Пример 1 Для создания удобрения испытана комбинация, состоящая из равного количества(в соотношении 11) бактерий обоих штаммов 2,5 млн. мк/г субстрата. Удобрение помещалось в аквариумы, заполненные прудовой водой, результаты учитывались через 48 часов. В результате дополнительных исследований было установлено,что в воде доминировали бактерии, их численность составляла 92 от общего количества азотфиксаторов. Как наиболее активный азотфиксаторКМИЭВ 7-16 Д подавлял численностьКМИЭВ 6-28 Д в условиях пищевой конкуренции. Поставленная задача не достигается, так как количествоКМИЭВ 6-28 Д недостаточно для подавления бактерий рода . 10942 1 2008.08.30 Пример 2 Для создания удобрения испытаны бактерииКМИЭВ 7-16 Д иКМИЭВ 6-28 Д в соотношении 14 соответственно (1 и 4 млн. мк/г). Аналогично примеру 1, бактериальное удобрение помещалось в аквариумы с прудовой водой. При учете результатов через 48 часов было установлено, что количество бактерий в воде приближалось к равновесию и составило 45 бактерий штаммаКМИЭВ 6-28 Д и 56 КМИЭВ 7-16 Д. Численность аэромонад по сравнению с контролем сократилась на 42 . Таким образом, симбиоз из бактериальных штаммов в соотношении 14 оказался оптимальным, отвечал поставленной задаче и лег в основу создания бактериального удобрения. Бактериальное удобрение производится в условиях лаборатории, представляет собой гранулы, в 1 г которого содержится не менее 5 млн. живых клеток азотфиксирующих бактерий. Удобрение расфасовывается в полиэтиленовые пакеты, маркируется, хранится в сухом помещении при температуре от 5 до 20 С. При хранении в данных условиях жизнеспособность бактерий сохраняется в течение года. Для производства удобрений разработана технологическая схема, состоящая из следующих этапов 1. Культивирование штаммов бактерий производится на жидкой питательной среде(модифицированный рецепт среды Эшби), содержащей в 1 л дистиллированной воды сахарозы - 20 г К 2 НРО 4, 472,- по 0,2 г 24 - 0,1 г СаСО 3 - 5 г. 2. Стерильная среда разливается в 2-х литровые емкости, в которые вносится по 10 мл смыва 2-х суточной агаровой культуры азотфиксирующих бактерий (каждый штамм в отдельной емкости). После 48 часов культивирования в термостатах при температуре 26-28 С подсчитывается количество бактерий методом прямого счета в 1 мл, затем готовится бактериальная смесь, содержащаяКМИЭВ 7-16 Д иКМИЭВ 6-28 Д в соотношении 14. Предварительно простерилизованный комбикорм (стерилизация сухим жаром 2 часа при температуре 120-130 С) погружается на 5 мин в резервуар с культуральной массой для адсорбции бактерий, после чего просушивается в термостате при температуре, не превышающей 37 С. 1 кг адсорбента поглощает в среднем 700 мл культуральной жидкости,т.е. содержит примерно 70 бактериальной биомассы, не инактивированной нагреванием. В 1 г полученного препарата (при влажности 7-9 ) содержится не менее 5 млн. живых клеток азотфиксирующих бактерий. Каждая партия полученного удобрения подвергается бактериологическому контролю. Бактериальное удобрение широко внедряется в рыбоводных предприятиях республики. Наибольший эффект получен при использовании его в выростных прудах. При этом рыбопродуктивность прудов повышается на 0,5-1,0 ц/га, рыбопосадочный материал за счет высоких показателей объектов кормовой базы (как фито-, так и зоопланктона) имеет большую массу и хорошие физиологические показатели (общая резистентность). Уровень заболевания воспалением плавательного пузыря (ВПП) ниже контрольного на 40-50 и протекает в более доброкачественной (хронической) форме. Влияние бактериального удобрения на продуктивность рыбоводных прудов на опытном ХРУ Вилейка представлено в таблице. 10942 1 2008.08.30 Влияние бактериального удобрения на продуктивность рыбоводных прудов Бактериопланктон Рыбоводные показатели экстенчисленрыбо сивность численчисленбиомасбиомас- ность, биомас- средняя продукпруда ность,ность, тыс. поражеса, мг/л са, мг/л тыс. са, мг/л масса, г тивность,ния ВПП,млн./мл экз./мг экз./мг ц/га Опытные пруды 1 2,7-4,2 2,2-3,3 938-1500 2,6-8,1 52-935 1-17,5 23,0 13,5 28,0 2 2,9-6,2 2,7-4,9 319-37000 1,0-11,8 95-375 4,3-62,5 30,0 6,6 22,0 сред 2,8-5,2 2,5-4,1 628,5-19250 1,8-9,9 73,5-655 2,7-40,0 26,5 10,1 25,0 нее Контрольные пруды 1 1,6-3,8 1,3-3,0 2125-6817 3,5-5,9 78-100 2,7-5,7 9,4 6,1 65,0 2 2,0-3,0 1,2-2,4 3516-9075 5,9-9,6 81-164 2,9-5,9 6,0 5,7 78,0 сред 1,8-3,4 1,25-2,7 2820,5-7946 4,7-7,7 79,5-132 2,8-5,8 7,7 5,9 71,5 нее Примечаниебактериальное удобрение внесено трижды за вегетационный сезонбактериальное удобрение не вносилось. Источники информации. 1. Гусев Е.Е. Химизация рыбоводства. - М. Россельхозиздат, 1985. - С. 90-91. 2. Винберг Г.Г., Ляхнович В.П. Удобрение прудов. - М. Пищевая промышленность,1965. - С. 232-233. 3. Винберг Г.Г., Ляхнович В.П. Удобрение прудов. - М. Пищевая промышленность,1965. - С. 90-91 (прототип). 4. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж.Хоулта / Пер. с англ. к.б.н. С.Ш. Тер-Казарьяна под ред. чл-корр. АН СССР Г.А. Заварзина. - М. Мир, 1980. - С. 123. 5. Патент 2971 , МПК 612 1/20, А 01 61/00. 6. ГОСТ 10385-88 СССР Комбикорма для прудовых рыб. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5