Способ определения антигемолитической активности химического соединения

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Литвинко Наталья Михайловна Кучуро Светлана Викторовна Рахуба Галина Николаевна Рубинов Дмитрий Брониславович Желдакова Татьяна Анатольевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) Литвинко Н.М. и др.съезд гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь. Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии Сб. научн. тр. к 70-летию НИИ гематологии и переливания крови. Т. 2. - Мн. НПООО Стринко, 2003. - С. 119-121.5752 1, 2003.(57) Способ определения антигемолитической активности химического соединения, включающий преинкубацию смеси исследуемого соединения с фосфолипазой А 2 яда змеи перед ее инкубацией с эритроцитосодержащим агарозным гелем и последующее определение антигемолитической активности химического соединения по отношению площади зоны гемолиза эритроцитов в агарозном геле в присутствии и в отсутствие исследуемого соединения, отличающийся тем, что преинкубацию исследуемого соединения с фосфолипазой А 2 проводят в течение 0,5-5,0 ч, а инкубацию с эритроцитосодержащим агарозным гелем проводят при температуре не выше 37 С. Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и может быть использовано в качестве контрольного теста при анализе на применение химических соединений в качестве лекарственных средств антигемолитического и антипаралитического профиля действия, в том числе в качестве противоядия. Воздействие ядов змей на организм млекопитающих связано с функционированием фосфолипазы А 2 (КФ 3.1.1.4 ФЛА 2) - важнейшего фермента липидного обмена в организме, катализирующего гидролиз сложноэфирной связи во втором положении 1,2-диацил-3-фосфоглицеридов 1. В частности, гемолитическое и нервно-паралитическое действие яда змей обусловлено активностью низкомолекулярной формы ФЛА 2 2. Действие многих лекарственных средств прямо или опосредованно связано с ингибированием активности фосфолипазы А 2. В частности, ницерголин, циннаризин, алигерон,пирацетам, которые используются в химиотерапии гипоксии, ингибируют фосфолипазу А 2. Местные анестетики хлорпромазин, лидокаин, тетракаин и др., а также антиаритмическое средство амиодарон являются сильными ингибиторами фосфолипазы А 2 яда 10604 1 2008.06.30 С. . 3. Следовательно, биохимическая реакция гидролиза фосфолипидов эритроцитарных мембран, катализируемая ФЛА 2, может служить чувствительным тестом для скрининга веществ с потенциальной антигемолитической и антипаралитической активностью. Методы определения активности ФЛА 2 трудоемки, требуют затраты больших количеств фермента, реактивов и времени, что создает определенные трудности при выявлении ингибиторной активности исследуемых эффекторов 4. Для успешного изучения ингибирования фосфолипазной реакции, в том числе и для выявления среди физиологически активных соединений лекарственных средств антигемолитического и антипаралитического профиля действия, необходимы предварительные экспрессные тесты на потенциальные ингибиторные свойства изучаемых соединений. Наиболее близким к заявляемому является способ проведения гемолиза в агарозе с использованием гемолитической сыворотки и суспензии эритроцитов барана 5 (прототип). Однако данный способ используется только в иммунологических целях для полуколичественной оценки общей активности комплемента в гемолитической сыворотке крови. Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения эффекторной активности любого ряда химических соединений, который может быть использован в качестве контрольного теста при определении сферы применения биологически активных соединений в качестве антигемолитических агентов. Поставленная задача решается заявляемым способом определения антигемолитической активности химических соединений путем установления ингибиторных свойств физиологически активных соединений по отношению к ферментативному гидролизу фосфолипидов эритроцитов с помощью выявления изменения гемолитической активности ФЛА 2. В соответствии с изобретением описывается способ определения антигемолитической активности химического соединения, включающий преинкубацию смеси исследуемого соединения с фосфолипазой А 2 яда змеи перед ее инкубацией с эритроцитосодержащим агарозным гелем и последующее определение антигемолитической активности химического соединения по отношению площади зоны гемолиза эритроцитов в агарозном геле в присутствии и в отсутствие исследуемого соединения, отличающийся тем, что преинкубацию исследуемого соединения с фосфолипазой А 2 проводят в течение 0,5-5,0 ч, а инкубацию с эритроцитосодержащим агарозным гелем проводят при температуре не выше 37 С. Вычисляют площади гемолизных зон в присутствии исследуемого соединенияи без него (0) и рассчитывают степень ингибирующего гемолиз действия по формуле 100 .0 Вследствие липолитического действия фосфолипазы А 2 на мутную эмульсию эритроцитов (субстрат), включенных в агарозный гель, вокруг лунки, содержащей фермент, образуется за счет выхода гемоглобина из форменных элементов крови ярко-красная зона просветления площадью 002 - 2, где 0 - радиус зоны просветления, а- радиус лунки. Поскольку имеется однозначная прямо пропорциональная зависимость между диаметром зоны просветления в субстратосодержащей агарозе и концентрацией фосфолипазы А 2 6, уменьшение площади зоны просветления должно указывать на уменьшение содержания свободного фермента, и если присутствие дополнительных веществ в лунке вызывает образование зоны просветления меньшей площади (2 - 2, где- радиус лунки,и- площадь и радиус зоны просветления в присутствии ингибитора, причем 0), то можно говорить об ингибирующем действии на фосфолипазу А 2 этих веществ. Тогда относительное уменьшение площади зоны просветления /0(2 - 2) / (022) может служить мерой остаточной гемолитической активности фермента в присутствии ингибитора. 2 10604 1 2008.06.30 Способ обнаруживает ряд преимуществ отличается хорошей воспроизводимостью(точность воспроизведения колеблется от 1,2 до 3 ), малым расходом фермента и других компонентов системы, позволяет одновременно проводить испытания нескольких десятков веществ (одна чашка Петри диаметром 88 мм позволяет произвести одновременно скрининг 8-10 веществ). Для поставленных целей особенно важно, что при проведении фосфолипазной реакции данным методом изменение концентрации субстрата не влияет на его состояние (организацию) в геле. В эритроцито-водных системах организация субстрата меняется с изменением его концентрации, а следовательно, по ходу реакции, что негативно сказывается на процессе гидролиза и создает определенные сложности при интерпретации результатов. Пластины с гемолитическими зонами можно сохранять при 4 С в течение 3-4 дней без ущерба для качества анализа. Для лучшего понимания сущности заявляемого изобретения приводятся примеры конкретного выполнения, не ограничивающие объема изобретения. Пример. Для определения эффекторных свойств физиологически активных соединений, в частности производных -трикетонов тиофенового ряда, по отношению к гемолитической активности фосфолипазы А 2 используют диффузию фермента в агарозном геле, содержащем эритроциты крови человека в качестве субстрата. Мерой ингибирования служит относительное уменьшение площади зоны просветления (/0), образующейся вследствие липолитического действия фермента на эмульсию эритроцитов, включенных в агарозный гель, которое рассчитывают по формуле/0(2 - 2) / (022),где , 0 - радиусы зон просветления в присутствии потенциального ингибитора и без него,- радиус лунки. Интактные эритроциты получают из цельной крови человека. Кровь с физиологическим раствором в соотношении (14) центрифугировали 15 мин при 2500 об/мин. Сливают надосадочную жидкость, а осадок эритроцитов отмывают физиологическим раствором и снова центрифугировали 15 мин при 2500 об/мин. Отмывание эритроцитов проводят 3 раза. Для приготовления геля используют 0,05 М веронал-ацетатный буфер 7,5, содержащий 0,8 агарозы и 1,6 мМ СаС 2, который прогревают на кипящей водяной бане в течение 25 мин, затем охлаждают до 50 С и смешивают с подогретым до 48 С 0,05 М веронал-ацетатным буфером 7,5, содержащим 27 эритроцитов. Полученную смесь заливают в нагретые до 48-50 С чашки Петри. Высота слоя геля в чашках Петри составляет 1 мм. После охлаждения в геле проделывают штампом отверстия диаметром 4 мм и объемом 12,5 мкл для внесения фермента. В одной чашке Петри диаметром 88 мм можно было сделать одновременно 8-10 отверстий. Водный раствор ФЛА 2 (10 мкг на пробу) преинкубируют 2 ч при комнатной температуре с раствором -трикетонов тиофенового ряда в диметилсульфоксиде (5 мкг на пробу). 12 мкл полученного раствора вносили в вырезанную в геле лунку. Чашки инкубируют 18 ч при 4 С, а затем в течение 5 ч при 37 С, затем замеряют площади зоны лизиса через 2 и 5 ч. Измерение диаметра зоны лизиса производили с помощью измерительной лупы с ценой деления 0,1 мм. На фигуре и в таблице представлены результаты первичного скрининга некоторых Площадь зоны просветления агарозного геля с эритроцитами под воздействием ФЛА 2 (с эффектом и без) через 2 и 5 ч инкубации чашек Петри при 37 С Относительное изменение площади зоны просветления при диффузии ФЛА 2,после ее преинкубации с -трикетонами тиофенового ряда, в гель,содержащий эритроциты Шифр соедиСтруктурная формула Название 10604 1 2008.06.30 Продолжение таблицы Шифр соединения ТК-13 Степень воздействия испытанных соединений на гемолитическую активность ФЛА 2 зависела от их химической структуры. Преинкубация ФЛА 2 с хлорсодержащим производным (ТК-13), обладающим подобно природным простагландинам карбоксильной группой в боковой цепи, приводила к ингибированию ФЛА 2 на 22 , что, возможно, обусловлено наличием сильно электроотрицательного (ЭО) заместителя. Данное предположение подтверждается сравнением полученных данных со структурой и функцией 3,5 дизамещенных производных тиотетроновой кислоты - 5-бензил-3-(3-фенил)пропаноил(3 Н,5 Н)-тетрагидротиофен-2,4-дион ( 1), 5-(3 хлорфенил-метилиден)-3-(3-хлорциннамоил)-(3 Н,5 Н)-тетрагидротиофен-2,4-дион ( 2), 5-(4 бромфенилметилиден)-3-(4-бромциннамоил)-(3 Н,5 Н)-тетрагидротиофен-2,4-дион ( 3). Источники информации 1. Брокерхоф ., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М. Мир, 1978. - С. 356. 2. Литвинко Н.М. Активность фосфолипаз А 2 и С при биохимическом моделировании. Мн., 2002. 3. Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фосфолипазы А 2. Структура и функция. Мн. Наука и техника, 1991. - 270 с. 4.,, // . - 1975. - . 114. -1. . 129-141. 5. Иммунологические методы / Под ред. Фримеля. - М., 1987. - 472 с. (прототип). 6. Патент РБ 5752, МПК 01 33/15,121/34, 2003. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5