Способ определения активности метаболизма этанола в гомогенате головного мозга животного

(51)( 01133148 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИ СОБСТВЕННОСТИ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИЗМАЭТАНОЛА В Г ОМОГ ЕНАТЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЖИВОТНОГО(71) Заявители Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет Государственное научное учреждение Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(72) Авторы Пронько Сергей Павлович Зиматкин Сергей Михайлович Пронько Павел Сергеевич (ВУ)Зиматкин С.М. Актуальные вопросы современной медицины Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 80-летию БГМУ. - Минск,2001, ч.1.- С. 141-143.Зиматкин С.М. Х съезд Белорусского общества физиологов Тезисы докладов. - Минск, 2001. - С. 61-62.(73) Патентообладатели Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет Государственное научное учреждение Институт биохимии Нацио нальной академии наук БеларусиСпособ определения активности метаболизма этанола в гомогенате головного мозга животного, включающий преинкубацию проб гомогената мозга в среде, содержащей 0,1 М калий-фосфатный буфер рН 7,4 и 10 мМ глюкозу, внесение этанола, остановку реакции, причем реакцию в контрольной пробе останавливают сразу, а в опытной - после инкубации с этанолом, газохроматографическое определение содержания ацетальдегида в пробах и определение активности метаболизма этанола по разнице в содержании ацетальдегида в опытной и контрольной пробах, отличающийся тем, что в среду преинкубации добавляют ингибитор альдегиддегидрогеназы цитраль до конечной концентрации 500 мкМ.Изобретение относится к области биохимии, а именно к аналитической биохимии, и может использоваться для оценки интенсивности окисления этанола в головном мозге.Наиболее близким к заявляемому является способ исследования метаболизма этанола в гомогенатах головного мозга крыс по накоплению в них продукта метаболизма этанола ацетальдегида (Шшашш 5.М., Ыоро А.У., Вейггйсп КА. ВТЗГТЬЦЙОП апб Кйпегйсз ОГ ег 11 апо 1 ШеШаЬОПЗШ ш га Ьгайп. А 1 со 11 о 115 ш С 11111 са 1 апб Ехрег 1 ше 1 па 1 Кезеагсп, 1998, Уо 1.22, 1 То.8,рр. 16231627). Способ включает перфузию мозга, гомогенизацию его образцов, преинкубацию в течение 10 минут, инкубацию в присутствии этанола и газохроматографическое определение накапливающегося в ткани ацетальдегида.Недостатки у этого способа следующие Метаболизм этанола оценивается не полностью, поскольку часть образующегося в процессе окисления этанола ацетальдегида бь 1 стро окисляется в ткани мозга альдегиддегидрогеназой до ацетата прямое определение убыли этанола также затруднено вследствие малой скорости окисления этанола, когда убыль этанола составляет от 1,14 до 5,16 от использованной концентрации, что может превышать ошибку измерения.Задача изобретения - повышение точности определения этанолметаболизирующей способности ткани головного мозга.Поставленная задача решается путем перфузии мозга, гомогенизации его образцов,преинкубации и инкубации в присутствии этанола, при этом после добавления этанола в контрольной пробе реакцию останавливают сразу же, а в опытной - после инкубации. Затем проводят газохроматографическое исследование проб, после чего определяют разницу между уровнем ацетальдегида в этих пробах, которая и показывает уровень накопления ацетальдегида из этанола. Отличительным моментом является то, что в среду преинкубации добавляют ингибитор альдегиддегидрогеназы цитраль в конечной концентрации 500 мкМ.Способ осуществляют следующим образом.Под тиопенталовым наркозом внутрисердечно животным (беспородным белым крь 1 сам-самцам гетерогенной популяции, массой 180-220 г) вводят 300-400 мл охлажденного до 4 С изотонического раствора хлорида натрия, содержащего 1000 ед. гепарина на литр. Мозг быстро извлекают, промывают в физиологическом растворе и помещают в жидкий азот для хранения. Образцы мозга взвешивают и гомогенизируют в гомогенизаторе со стеклянной ступкой и тефлоновым пестиком. 10 -ный гомогенат готовят на ледяном 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 0,1 Тгйоп Х 100. В 2 флакона объемом 15 мл, содержащих 0,3 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,4) с 10 мМ глюкозой и 0,05 мл цитраля в конечной концентрации 500 мкМ, вносят по 0,25 мл 10 -ного гомогената мозга (контрольная и опытная пробы) и преинкубируют в течение 20 мин при 37 С. Затем в пробы вносят 0,1 мл этанола (50 мМ конечная концентрация). В контрольных пробах реакцию останавливают сразу после добавления этанола. Опытные пробы инкубируют 30 мин при 37 С, после чего реакцию останавливают. Реакцию останавливают добавлением депротеинизирующего раствора, содержащего 0,25 мл 3 М хлорной кислоты с 1 мМ 1-пропанолом, используемым в качестве внутреннего стандарта. Перед депротеинизацией в пробы для снижения артефактного образования ацетальдегида вносят 0,05 мл дезферриоксамина (5 мМ конечная концентрация) (6111 К., Мепе 2 113., Ьисаз 13., Вейггйсп КА. Епиушайс ртобисйоп оГ асегаШеЬубе Ггош ег 11 апо 1 111 та Ьгайп йззие // А 1 со 11 о 115 ш С 11 п 1 са 1 апб Ехрег 1 ше 1 па 1 Ке 5 еагс 11. 1992. Уо 1. 16. Р. 910-915).Перед определением концентрации ацетальдегида пробы инкубируют 15 мин при 65 С и 1 мл парогазовой фазы вводят в газовый хроматограф НР 6890 с ПИД и колонкой(2,5 м длиной, с внутренним диаметром 2 мм, наполненной хроматоном Ы-АШ-ВМСЗ,пропитанным сагЬоуах 5 20 М), температура инжектора 170 С, печи 70 С, детектора 220 С. Определяют содержание ацетальдегида в опытных пробах и контрольных. Определяют разницу между полученными показателями, которая и показывает уровень накопления ацетальдегида из этанола. Содержание белка в гомогенатах определяют по методу Ьошгу е а 1. (1951), используя сывороточный альбумин быка как стандарт. Единица измерения количества наработанного из этанола ацетальдегида наномоль ацетальдегида/мг белка/час.Инкубацию проб проводят при 37 С, поскольку эта температура является оптимальной для протекания биохимических реакций. При концентрации цитраля 500 мкМ активность альдегиддегидрогеназы была равна активности альдегиддегидрогеназы в гомогенате мозга после термической обработки (10 минут при 100 С), что говорит о полном подавлении активности фермента.В таблице приведены данные по наработке ацетальдегида из этанола гомогенатами мозга Крыс при различных концентрациях цитраля в пробе, иллюстрирующие полученные результаты.Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипомспособ позволяет исключить ферментативное окисление ацетальдегида в пробе и оценить Максимальную скорость окисления этанола в мозгеспособ позволяет повысить Чувствительность метода и использовать меньщее количество гомогената, что позволит исследовать метаболизм этанола в отдельных регионах и субклеточных фракциях мозгаповышение уровня ацетальдегида позволяет повысить точность метода.Способ прост в осуществлении, достаточно надежен, хорошо воспроизводим и может быть использован в любой биохимической лаборатории, оснащенной газовым хромато графом.Наработка ацетальдегида гомогенатами мозга из этанола 5 0 мМ конечная концентрация) после инкубации- достоверно (р 0,05) относительно контрольной группы - достоверно (р 0,01) относительно контрольной группы.Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.