Реакционный состав для определения активности фосфат-независимой глутаминазы в биологических образцах

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ РЕАКЦИОННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФАТ-НЕЗАВИСИМОЙ ГЛУТАМИНАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Валюк Татьяна Чеславовна Величко Магдалена Григорьевна Нефедов Леонид Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси(57) Реакционный состав для определения активности фосфат-независимой глутаминазы в биологических образцах, содержащий трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид, двухзамещенный фосфат калия, хлорид калия, динатриевую соль малеиновой кислоты, глутамин и воду дистиллированную, отличающийся тем, что дополнительно содержит никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД), -метилфеназинметосульфат и дихлорфенолиндофенол при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид 99,5-100 двухзамещенный фосфат калия 0,9-1,0 хлорид калия 0,09-0,1 динатриевая соль малеиновой кислоты 24,5-25,0 Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано для оценки процесса утилизации -глутамина с помощью фермента фосфат-независимая глутаминаза в различных биологических образцах. 6838 1 Наиболее близким к заявляемому является реакционный состав для определения активности фосфат-независимой глутаминазы, содержащий трис-(оксиметил)-аминометангидрохлорид - 100 мкмоль/л, двухзамещенный фосфат калия - 1 мкмоль/л, хлорид калия 0,1 мкмоль/л, малеиновую кислоту - 25 мкмоль/л, -глутамин - 10 мкмоль/л, воду дистиллированную - остальное ( .// - 1974. - . 334. - . 199-207). Для остановки реакции используется трихлоруксусная кислота, карбонат калия, серная кислота и нитропруссид-феноловый реактив (Исмаилов И.А., Эмирбеков Э.З. Глутаминазная и глутаматдекарбоксилазная активность ткани мозга при гипотермии и зимней спячке // Укр. биохим. жур. - 1980. - . 52. -6. - С. 683-688). Недостатками данного реакционного состава являются обязательное наличие безаммиачной воды, выпадение осадка после остановки реакции, что требует дополнительного центрифугирования проб перед работой на регистрирующих приборах, работа с токсичными веществами (ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты), длительность процесса постановки реакции для определения активности фермента вследствие получасовой инкубации проб и дополнительного центрифугирования, невозможность работать с биологическими образцами, отобранными у животных с экспериментальными опухолями (например, ткань печени, опухоли). Задачей изобретения является создание нового реакционного состава для определения активности фосфат-независимой глутаминазы, сокращения времени постановки реакции,повышения доступности и надежности определения, работы с образцами тканей, отобранными у опухоленосителей. Задача достигается тем, что в реакционный состав по сравнению с прототипом добавлены никотинамидадениндинуклеотид окисленный, -метилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол, увеличена концентрация субстрата, исключены ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты. Это способствует повышению надежности и доступности определения активности фосфат-независимой глутаминазы в промежутке времени 10 мин при оптимальной температуре инкубации среды (37 С). Заявленный реакционный состав для определения активности фосфат-независимой глутаминазы содержит трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорида, двухзамещенный фосфат калия, динатриевую соль малеиновой кислоты, хлорид калия, -глутамин, никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД), -метилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид - 99,5-100 двухзамещенный фосфат калия - 0,9-1,0 хлорид калия - 0,09-0,10 динатриевая соль малеиновой кислоты - 24,5-25,0 -глутамин 19,5-20,0 НАД - 10 -метилфеназинметосульфат - 0,0065 дихлорфенолиндофенол - 0,02 вода дистиллированная - остальное. Предложенные нововведения обосновываются следующим образом 1) -глутамин в концентрации 20 мкмоль/л позволяет работать с образцами тканей,отобранными у животных-опухоленосителей, поскольку развитие онкопроцесса связано с избыточным потреблением глутамина опухолью ( .,// . . . - 1997. - .122. -2. . 451-464) 2) никотинамидадениндинуклеотид окисленный облегчает двусторонний обмен атомами водорода и электронами, отделенными от субстрата, и акцепторами электронов(МакМюррей У. Обмен веществ у человека. - . Мир, 1980. - С. 118) 3) -метилфеназинметосульфат - акцептор электронов, осуществляющий перенос электронов на последующий акцептор 4) дихлорфенолиндофенол - акцептор электронов, снимающий электроны с -метилфеназинметосульфата, в результате чего развивается окраска акцептора от темно-синей 6838 1 Заявленный реакционный состав использовали для определения активности фосфатнезависимой глутаминазы в шести образцах из тканей печени и опухоли крыс-опухоленосителей саркомы -1 в трех независимых сериях опытов. За ходом реакций следили на регистрирующих приборах - спектрофотометры -2 и -221, при 600 нм по приросту оптической плотности вследствие наработки продукта. В таблице представлены полученные расчетные данные по активности фосфат-независимой глутаминазы из тканей крыс-опухоленосителей с применением заявленного реакционного состава. Активность фосфат-независимой глутаминазы, полученная путем применения заявленного реакционного состава в различных сериях опытов, мкмоль ДХФИФ/мин-г белка Образец ткани печени опухоли Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют об оптимальном соотношении компонентов заявленного реакционного состава для определения активности фосфатнезависимой глутаминазы в диапазоне указанных выше концентраций, поскольку это не дает большой вариации данных по активности фермента, позволяет получать воспроизводимые результаты. Заявленный реакционный состав для определения активности фосфат-независимой глутаминазы может быть широко использован в биохимической и медицинской практике для диагностики злокачественных новообразований и разработки стратегии их лечения,поскольку изменение активности фермента в раковой ткани коррелирует со степенью ее злокачественности. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.