Способ получения аденозина

07 19/167, 12 119 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(73) Патентообладатель Ляховец Владимир Иванович(57) Способ получения аденозина из аденина и рибонуклеозидного источника рибозы ферментативным трансгликозилированием аденина покоящимися клетками, штамм БМ 21 в присутствии неорганического фосфата, при рН 7,5 и температуре 60 С, и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве источника рибозы используют природные рибонуклеозиды пуриновой или пиримидиновой природы, или их смесь, выделение проводят с использованием ионообменников, затем, применяя селективную элюцию на цис-гидроксильные группы углеводной части молекулы, отделяют азотистые основания от оставшегося в реакционной смеси рибонуклеозида, который используется в следующем цикле получения аденозина. Предлагаемое изобретение относится к микробиологическим способам получения нуклеозидов,а именно к способу получения аденозина- природного нуклеозида, который применяется в научных исследованиях, а также в качестве исходного сырья для получения АМФ, АТФ и других биологически активных веществ нуклеиновой природы. Из известных способов получениянаиболее близким к заявляемому способу по технической сущности является способ 1, предусматривающий его синтез из о ис помощью, в качестве биокатализатора, интактных клеток ссБМ-21 (ВКПМВ-2752) в присутствии неорганического фосфата при 60-65 С и рН 7,5 с последующим выделением кристаллизацией на холоду. Недостатками способа-прототипа являются 1 - потери целевого продукта при выделении из реакционной среды кристаллизацией составляют около 202 - при оптимальном для прототипа молярном соотношении в реакционной смеси о и(21) выходдостигает 76,1 по отношению к . Но при этом используется лишь 41-42 добавленного о. Уменьшение относительного количества о в реакционной смеси увеличивает степень его использования, однако резко ухудшает процесс выделениякристаллизацией. Указанные недостатки способа - прототипа ограничивают возможность его применения в условиях промышленного производства, так как о, используемый в качестве самостоятельного лекарственного средства Рибоксин, является в настоящее время сравнительно дорогим компонентом - субстратом. Целью предлагаемого изобретения является усовершенствование способов полученияза счет как более полного его выделения из реакционной смеси, так и более эффективного использования рибозосодержащего сырья (вышеназванных нуклеозидов). Это достигается благодаря под 3214 1 бору условий выделения колоночной ионообменной хроматографией целевого продукта и рибонуклеозидов - доноров рибозы, остающихся в реакционной смеси и используемых в последующих циклах ферментативной наработки аденозина. Указанная цель достигается тем, что после полученияаналогичным с прототипом способом либо с другим нуклеозидом (уридином, цитидином, гуанозином или их смесью) реакционная смесь прогревается, осветляется центрифугированием (5000 , 10 мин) или фильтрацией, наносится на ионообменную колонку с АВ-17 в ОНформе. Последовательно элюируют , затем отдельной фракцией нуклеиновые основания, наконец,оставшиеся нуклеотиды - доноры рибозы, используемые в ферментативной наработке . Представленный в заявке способ получения , включающий ионообменную хроматографию,обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества 1. Снижение потерь целевого продукта в процессе выделения 2. Снижение затрат рибонуклеозидного сырья на получение единицы целевого продукта в 2 раза 3. Снижение затратпри использовании схемы его реутилизации, представленной в примере 4 4. Предлагаемый способ выделения позволяет варьировать соотношение нуклеозида - донора и, а также макси-расширить ассортимент используемых для получениядругих нуклеозидов, включая их смесь. Сущность изобретения поясняется примерами его исполнения. Пример 1. В реакционный сосуд вносят 25 г , 100 г инозина(о) и 900 мл 0,02 М фосфатного буфера,рН 7,3. Смесь нагревают до 60 С и вносят в нее 1 г (в расчете на сухую массу) интактных клетокБМ-21, суспендированных в 20 мл того же буфера. Клетки предварительно выращивали глубинным культивированием при 37 С в течение 16 часов на среде, содержащей вглюкозу - 0,1 пептон - 2,0 дрожжевой экстракт - 2,0 24 0,6 К 2 Р 4 - 0,3- 0,1 4 х 7 2 - 0,002. Полученную реакционную среду с клетками доводят до объема 1 литр 0,02 М фосфатным буфером и инкубируют при 60 С с периодическим перемешиванием в течение 22 часов. Выходсоставляет 77,8 по отношению к , что соответствует 38,6 г. После остановки реакции 15-минутным прогреванием и осветления центрифугированием (5000, 10 мин) конечную реакционную смесь наносят на ионообменную колонку, наполненную анионообменником АВ-17 М в ОНформе, 50 х 250 мм, объемом 500 мл.элюируют дистиллированной водой. За ходом элюции следят с помощью - детектора (при 260 нм). (Замена дист. воды в качестве элюэнта на 80 водный метанол в 7 раз уменьшает объем фракциии время его элюции). Собранный элюат упаривают на роторном испарителе до объема 150 мл и кристаллизуютна холоду в течение 15 ч. Полученный осадок фильтруют и сушат в суховоздушном шкафу при 100 С. Вес сухого осадка 33,5 г, чистота полученного 96 . После отбора фракциис колонки элюируюти гипоксантин 0,2 М борной кислотой и промывают колонку 250 мл дистиллированной воды. Оставшийся на колонке о элюируют 0,1 М уксусной кислотой и упаривают элюат до сухого остатка. К сухому остатку дважды добавляют по 30 мл метанола и выпаривают на роторном испарителе. Осадок содержит 50,5 г о. Выделенный о может быть использован в дальнейших циклах полученияв смеси с новой порцией о или отдельно. В последнем случае, для реутилизации выделенного о, его растворяют в 200 мл воды, доводят значение рН раствора до 7,3 с помощью концентрированного раствора КОН. К полученному раствору добавляют 200 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,3 и 12,6 г . Реакционную смесь прогревают до 60 С с перемешиванием и начинают ферментативную реакцию добавлением клетокБМ-21 (0,5 г в расчете на сухую массу клеток). Условия и время проведения 2 3214 1 реакции аналогичны таковым для исходного цикла наработки. Выделение проводят аналогичным образом. Выходсоставляет 73 , что соответствует 18 г. При использовании смеси новой порции о и выделенного в предыдущем цикле выходсоставляет 73-77 . Оставшийся в реакционной смеси о (26 г) может использоваться в последующих циклах получения . Пример 2. Получениеиз уридинаи . Все условия и количества (молекулярные соотношения) аналогичны данным в примере 1, но вместо о используюти реакцию завершают через 6 часов. Выходдостигает 90,3 , что соответствует 44,6 г. Выделение , а также фракциис урациломаналогично описанному выше. Вес выделенного 40 г, чистота 96 .(Смесьиразделима с помощью сильного катионообменника (например, КРС-8 П) и,таким образом,может быть реутилизован наряду с нуклеозидами). Уридин, оставшийся в реакционной смеси (36 от исходного его количества) элюируют 0,1 М уксусной кислотой. Собранную фракцию уридина нейтрализуют до значения рН 6,0 раствором аммиака и упаривают до минимального объема. К выпаренному остатку добавляют два раза по 20 мл этилового спирта и выпаривают до сухого остатка. Выделенныйможет быть использован в дальнейших циклах полученияв смеси с новой партиейили отдельно. В последнем случае полученный уридин растворяют в 150 мл дист. воды, доводят значение рН 7,5 добавлением концентрированного раствора КОН, добавляют 150 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,5 и 8,5 г . Доводят объем смеси до 400 мл дистиллированной водой, прогревают до 60 С и начинают реакцию добавлением клетокБМ-21 (400 мг по сухому весу). Через 6 часов реакции выходсоставляет 89 , или 15 г. Оставшийся уридин (12 г) может быть использован в последующих циклах наработки . Суммарная степень препаративного полученияиз уридина (и )80 . Получениеиз цитидинаипроводят почти аналогичным способом. Различия заключались в том, что реакцию начинают с фосфатным буфером, имеющим значение рН 6,0, кроме того, в течение первого часа реакции поддерживают значение рН 7,0-8,5 с помощью уксусной кислоты. Реакцию проводят при перемешивании в открытом сосуде. Через 0,5 часа от начала реакции основное количествопревращается в , поэтому дальнейшую наработку, выделение и реутилизацию (уридина) проводят аналогичным вышеописанному способом. Выходсоставляет 85-88 по отношению к . Пример 3. Получениеиз гуанозинаи . К 800 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,3 добавляют 15,6 ги 6,8 г(молярное соотношение 1110). После прогревания при температуре 60 С к смеси добавляют 20 мл суспензии клетокБМ-21 (400 мг сухого веса). Реакцию проводят при 60 С с перемешиванием в течение 22 часов. Выходсоставляет 68 к исходному , или 9,1 г. После окончания реакции смесь фильтруют, прогревают до кипения, охлаждают и сразу наносят на колонку с анионообменником АВ-17 М в ОНформе, 50 х 250 мм, объемом 500 мл, со скоростью 200 мл/час. Аденозин элюируют водой, элюат упаривают до 25 мл и помещают в холодильник для формирования кристаллического осадкапри температуре 0-5 С на 16 часов. Осадок фильтруют на стеклянном фильтре и сушат до постоянного веса при 100 . Вес полученного 8 г, чистота 95 . После элюции аденозина оставшиеся компоненты (в основном этои , так как гуанин,образующийся в реакционной смеси, очень слаборастворим и удаляется фильтрацией) элюируют 0,1 М уксусной кислотой. Полученный элюат нейтрализуют раствором аммиака до рН 6,5-7,5 и упаривают до минимального объема. Осадок растворяют в 300 мл 0,02 М фосфатного буфера, рН 3 3214 1 7,3 при нагревании и при 60 С добавляют 30 мл суспензии клетокБМ-21 в аналогичном буфере (120 мг сухой массы). Через 16 часов реакции, проводимой с перемешиванием и термостатированием при 60 С, выходк оставшемусясоставил 40(молярных) или 1,6 г. Выделяют с помощью ионообменной колонки 1,3 гчистотой 95 . Суммарная эффективность наработкив описанной выше двухцикловой схеме составляет 80 относительнои . Пример 4. Получениеиз гидролизата РНК и . Непосредственным донором рибозы является сумма нуклеозидов, входящих в гидролизат РНК,который получают следующим образом Растворяют 50 г натриевой соли РНК (Олайна) в 1 литре 0,005 М 2 и доводят с помощью уксусной кислоты значение рН 5,5. Полученный раствор помещают в термостат с температурой 55 С. После нагревания к раствору добавляют 105 г (15 г сухого веса) измельченного сырого мицелияБМ-33 , выращенного глубинным культивированием, и перемешивают в течение всего времени гидролиза РНК. Через 20 часов гидролиза отделяют мицелий фильтрованием через ткань, доводят значение рН 7,3 с помощью КОН, добавляют 10 г аденина и растворяют его 15-минутным прогреванием до 100 С при перемешивании. Снижают температуру до 60 С и к полученному раствору добавляют суспензию клетокБМ-21 (1 г в расчете на сухую массу). Через 5 ч реакцию прекращают 5-минутным прогреванием до 100 и после охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь осветляют центрифугированием(5000 , 10 мин). Количествов гидролизате РНК (Олайна) составляет 14,35 от исходного количества РНК. После проведения реакции трансгликозилирования свыходдостигает 37,8 к исходному количеству чистой РНК (увеличен в 2,6 раза). Реакционную смесь порционно наносят на колонку с анионообменником АВ 17 М в ОН-форме, объемом 1750 мл со скоростью протока 1000 мл/час. Скорость промывания и элюции дист. водой составляет 3 л/час. Ход элюцииконтролируют с помощью -детектора. Из собранной фракциивыделяли упариванием под вакуумом и кристаллизацией на холоду - аналогично способу, описанному в примере 1. После отбора фракцииколонку промывают дистиллированной водой и элюируют нуклеиновые основания 0,2 М боратом при той же скорости протока. После увеличения оптической плотности элюата (при 260 нм) до 1 о.е./мл присоединяют последовательно вторую колонку с катионообменником КРС-8 П в Н-форме, объемом 500 мл. Скорость элюции - 1000 мл/час. После завершения элюции боратоми , выходящих совместно с первой колонки, и соответствующего падения оптической плотности до 0,5 о.е./мл колонку промывают дистиллированной водой, а контроль за элюатом переносят с первой на вторую колонку. (Первую колонку на этом этапе выводили из системы элюции.) Завершив элюцию(дистиллированной водой), со второй колонки приступают к элюции 0,54 О. Полученные фракцииупаривают на роторном испарителе до сухого остатка. Выпаренный осадок двухкратно ресуспендируют с 50 мл этанола и вновь выпаренный осадокиспользуют для дальнейшей наработки . Полученныйспособен к эффективной конверсии в . Потерив процессе реутилизации составляют около 10 . Степень использованияпо вышеописанному методу повышается в 1,5 раза по сравнению со способом без выделения и реутилизации . Гидролиз РНК может быть проведен другими способами. Наряду с гидролизатом РНК в данной схеме могут быть использованы различные смеси природных нуклеозидов - доноров рибозы. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 4