Способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток в патогенетической иммуносупрессивной терапии

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ ТЕРАПИИ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Зафранская Марина Михайловна Нижегородова Дарья Борисовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток в патогенетической иммуносупрессивной терапии, заключающийся в том, что получают мононуклеары периферической крови и мезенхимальные стволовые клетки пациента, мононуклеары периферической крови в течение 6 дней культивируют в питательной среде с фитогемагглютинином, а также в питательной среде с фитогемагглютинином и мезенхимальными стволовыми клетками, обе полученные культуры клеток окрашивают моноклональными антителами к 3 антигену и к рецептору -интерферона 119-клеток,регистрируют количество 3119 Т-клеток в обеих культурах, рассчитывают индекс 119 в процентах по формуле 119100, где- количество 3119-клеток, полученных при культивировании мононуклеаров периферической крови в питательной среде с фитогемагглютинином,МСК - количество 3119-клеток, полученных при культивировании мононуклеаров периферической крови в питательной среде с фитогемагглютинином и мезенхимальными стволовыми клетками,и судят о возможности использования мезенхимальных стволовых клеток в патогенетической иммуносупрессивной терапии при значении 11929,6 . 18065 1 2014.04.30 Способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток в патогенетической иммуносупрессивной терапии. Изобретение относится к медицине, к разделам иммунологии, трансплантологии, клеточной биологии. Проблема применения мезенхимальных стволовых клеток при различных заболеваниях заключается в том, что не всегда является возможным оценить иммуносупрессивный потенциал мезенхимальных стволовых клеток для использования клеточного трансплантата в патогенетической терапии. Процедура получения клеточного трансплантата на основе мезенхимальных стволовых клеток является дорогостоящей и трудоемкой, в связи с чем целесообразно проведение предварительной индивидуальной оценкииммуносупрессивной способности мезенхимальных стволовых клеток для определения их возможности использования в качестве клеточного трансплантата у пациента. Один из известных молекулярных механизмов, определяющих иммуносупрессивный потенциал мезенхимальных стволовых клеток, опосредован взаимодействием -интерферона со своим рецептором 119 на мезенхимальных стволовых клетках и лимфоцитах периферической крови. Источников информации, близких к заявляемому способу, прототипа не обнаружено. Задачей заявляемого способа является определение возможности использования мезенхимальных стволовых клеток для патогенетической терапии, что позволит дифференцированно использовать клеточные культуры мезенхимальных стволовых клеток,исключить затраты на подготовку несостоятельных клеточных трансплантатов и повысить эффективность лечения пациентов. Поставленная задача решается следующим способом. Предложен способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток в патогенетической иммуносупрессивной терапии, заключающийся в том, что получают мононуклеары периферической крови и мезенхимальные стволовые клетки пациента, мононуклеары периферической крови в течение 6 дней культивируют в питательной среде с фитогемагглютинином, а также в питательной среде с фитогемагглютинином и мезенхимальными стволовыми клетками, обе полученные культуры клеток окрашивают моноклональными антителами к 3 антигену и к рецептору -интерферона 119-клеток, регистрируют количество 3119-клеток в обеих культурах и определяют индекс изменения количества 3119-клеток в обеих культурах, рассчитывают индекс 119 в процентах по формуле 100,119100 МСК где- количество 3119-клеток, полученных при культивировании мононуклеаров периферической крови в питательной среде с фитогемагглютинином,МСК - количество 3119-клеток, полученных при культивировании мононуклеаров периферической крови в питательной среде с фитогемагглютинином и мезенхимальными стволовыми клетками,и судят о возможности использования мезенхимальных стволовых клеток в патогенетической иммуносупрессивной терапии при значении 11929,6 . Мезенхимальные стволовые клетки могут быть выделены из костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови, амниотической оболочки плаценты, скелетных мышц и др. Пример 1. Пациенту А., 36 лет, диагноз рассеянный склероз, запланирована трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (МСК). У пациента был осуществлен забор периферической венозной крови, из которой методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин были выделены и временно криоконсервированы в жидком азоте моно 2 18065 1 2014.04.30 нуклеары периферической крови (МПК). МСК были взяты из костного мозга пациента методом культивирования в питательной среде. После получения культуры МСК МПК были отмыты полной культуральной средой(-1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки) и засеяны в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2105 клеток/лунку вместе с МСК, которые добавляли в соотношении 101. Клетки культивировались в питательной среде, содержащей 2,5 мкг/мл митогена фитогемагглютинина в течение 6 дней в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С, причем одновременно культивировались МПК без добавления МСК в той же среде. Регистрация количества 3119-клеток в обеих культурах осуществлялась на 6-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого клеточные культуры окрашивались моноклональными антителами к 3 антигену -клеток и к рецептору-интерферона 119, меченых флуоресцентными метками, в течение 15 мин в темноте. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Количество 3119-клеток в культуре МПК, стимулированной митогеном фитогемагглютинином, в отсутствии и присутствии МСК у пациента А. Количество 3119-кле- Количество 3119-клеток в культок в культуре МПК ,туре МПК с добавлением МСК (МСК),Пациент А. 38,6 73,8 Согласно полученным данным был подсчитан индекс изменения количества 3119-клеток 119 по формуле 38,610010011910010047,7. 73,8 МСК Таким образом, индекс изменения количества 3119-клеток 119 составил более 29,6 , что свидетельствует о наличии возможного терапевтического эффекта МСК при использовании клеточных культур в патогенетическом лечении. В связи с этим пациенту А. рекомендовано проведение трансплантации МСК. Пример 2. Пациенту Б., 33 года, диагноз хронический миелолейкоз, была выполнена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток после предварительно проведенного режима кондиционирования и запланирована трансплантация МСК для предупреждения развития реакции трансплантант против хозяина. У пациента был осуществлен забор периферической венозной крови, из которой методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин были выделены и временно криоконсервированы в жидком азоте МПК. После получения культуры МСК МПК были отмыты полной культуральной средой(-1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки) и засеяны в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2105 клеток/лунку вместе с МСК, которые добавляли в соотношении 101. Клетки культивировались в питательной среде, содержащей 2,5 мкг/мл митогена фитогемагглютинина в течение 6 дней в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С, причем одновременно культивировались МПК без добавления МСК в той же среде. Регистрация количества 3119-клеток в обеих культурах осуществлялась на 6-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого клеточные культуры окрашивались моноклональными антителами к 3 антигену Т-клеток и к рецептору Согласно полученным данным был подсчитан индекс изменения количества 3119-клеток 119 по формуле 119100 Таким образом, индекс изменения количества 3119-клеток 119 составил менее 29,6 , что свидетельствует об отсутствии возможного терапевтического эффекта МСК при использовании клеточных культур в патогенетическом лечении. В связи с этим пациенту Б. не рекомендовано проведение трансплантации МСК. Вывод. Предлагаемый способ определяет возможность использования МСК для патогенетической иммуносупрессивной терапии при различных заболеваниях, что позволит дифференцированно использовать клеточные культуры МСК и исключить затраты на подготовку несостоятельных клеточных трансплантатов. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4